白念珠菌Ras/cAMP/PKA通路的研究进展

鲁仁义 马钱瑶 张晓龙 曹永兵 王彦 阎澜 姜远英

(1.中国人民解放军第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016)

·综述·

白念珠菌Ras/cAMP/PKA通路的研究进展

鲁仁义1马钱瑶2张晓龙1曹永兵1王彦1阎澜1姜远英1

(1.中国人民解放军第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016)

白念珠菌是一种重要的条件致病真菌，Ras/cAMP/PKA信号通路在白念珠菌的多种生理过程中发挥作用，如形态转换、黏附、生物被膜形成等，对于维持白念珠菌的毒力以及侵袭能力是十分重要的。对这一信号通路的深入研究有助于更好地了解白念珠菌对人体致病的机制，给抗真菌新药的研发提供新的思路。该文重点阐述通路相关蛋白功能、上下游调控关系及机制。

白念珠菌；Ras/cAMP/PKA信号通路；形态转换

由于器官移植术后免疫抑制剂的使用，肿瘤放疗化疗患者的增加，介入治疗和驻ICU患者的增加，艾滋病的流行和广谱抗生素的大量使用等原因，侵袭性真菌感染发病率呈明显上升趋势[1]。

白念珠菌是最常见的机会致病真菌，主要侵袭和感染机体口腔黏膜、消化道、阴道等部位，在免疫力低下人群中易引发系统性念珠菌感染，累及多个脏器[2]。白念珠菌有酵母态及菌丝态两种形态，形态转换对于白念珠菌的致病力是至关重要的，在机体内，菌丝态的白念珠菌具有更强侵袭性。

菌丝形成、形态转换、生物被膜形成、甾醇合成、糖酵解等一系列生物和代谢过程对白念珠菌的生长繁殖及致病力都是十分重要的[3-4]，这些过程由多条信号通路参与调控，其中Ras/cAMP/PKA通路至关重要[5]，有望从中发现抗真菌药物新的重要靶点 (见图1)。本文综述了白念珠菌Ras/cAMP/PKA信号通路中各相关分子的上下游关系及分子调控机制，重点阐述通路中关键基因及蛋白质的生物学功能及表达调控机制。

1 Ras、Ira2和Cdc25

Ras是高度保守GTP酶家族中的成员，在许多重要的细胞生长和分化信号通路中起着重要的“分子开关”的作用。

图1 白念珠菌中Ras/cAMP/PKA通路示意图(黑色箭头表示激活作用，红色线表示抑制作用)

Fig.1 Schematic diagram of Ras/cAMP/PKA pathway inCandidaalbicans(Black arrows indicate activation and red lines indicate suppression)

Ras属于小G蛋白家族 (与普通G蛋白由αβγ三个亚基组成异三聚体不同，以单体分子存在，并且分子量只有20～35 kD)，Ras有GTP结合的活化状态和GDP结合的非活化状态两种存在形式，当其处于活化状态时，可使下游的效应分子活化，两者之间的转换依赖于Ras本身具有的GTP酶活性[6]。

RAS1在白念珠菌的形态转换过程中发挥着重要的作用[7]，能促进菌丝的形成，当RAS1基因被敲除后，白念珠菌生长减慢、呈假菌丝样生长、菌丝形成能力减弱、胞内cAMP水平显著降低，将Ras1第13位的甘氨酸突变成缬氨酸后，Ras1活性显著增强，胞内cAMP含量升高且菌丝形成能力增强[8]。除Ras1外，白念珠菌中还存在另一个非典型的鸟苷酸结合调节蛋白Ras2，Ras2与Ras1有拮抗作用，RAS2单敲除的菌株增殖速度、cAMP含量以及菌丝生长基本与野生型一致，但RAS1和RAS2双敲除的菌株中，cAMP的含量是亲本菌的30%，但比RAS1单敲除菌株高约6～7倍，且生长速率恢复到亲本菌水平[9]。以上结果表明RAS1在白念珠菌中cAMP水平调控、菌丝生长及形态转换发挥着重要的作用。另外，最新研究表明，在RAS1缺失菌中，由TORC1介导的核糖体生物合成减少，从而导致了菌株对两性霉素B耐受性升高[10]。

葡萄糖和血清无法诱导RAS1缺失菌中cAMP生成，RAS1缺失菌形态转换的缺陷可以通过外源性cAMP解救，这两种表型在CDC25缺失菌中也能观察到[11]，表明CDC25和RAS1是在cAMP-PKA通路的上游发挥作用的。Cdc25是参与Ras1-GTP/GDP转换的鸟苷酸交换因子，能够激活Ras1，当CDC25被敲除后，菌株中Ras1-GTP水平降低并且不能形成菌丝[12]。而Ira2能够激活Ras1的GTP酶活性，负性调控Ras1的活性，使Ras1-GTP分解为Ras1-GDP，IRA2缺失会导致Ras1/cAMP/PKA通路的持续激活，进而增强菌丝生成[13]。此外，Seneviratne等[14]通过筛选单倍体突变文库，揭示了IRA2还参与了生物被膜的形成，发挥着正向调控的作用。最新的研究表明[12]，白念珠菌中Ras1的活性与线粒体活性也密切相关，线粒体抑制剂能够显著减少Ras1与GTP的结合，并且在其他念珠菌中也能观察到类似的效应。线粒体氧化呼吸活性和Ras1-GTP结合之间有密切关系，缺少复合物I或复合物IV的菌株在菌丝诱导条件下依然呈酵母状生长，并且具有较低水平的Ras1-GTP。

2 Cyr1、Srv2、Gpr1和Gpa2

CYR1 (又称CDC35)在白念珠菌中负责编码腺苷酸环化酶 (adenylate cyclase，AC)，CYR1缺失菌菌丝形成缺陷，cAMP含量下降。AC在细胞内的的作用是催化ATP生成cAMP，在白念珠菌的凋亡、CO2感知等过程中发挥重要作用，是Ras1的下游效应物。在Fang等[8]的研究中，酵母双杂交实验证明Ras1是与Cyr1的RA (Ras-association)结构域相互作用而发挥激活AC作用的，当Ras1与GTP结合时，可以与AC上保守的RA结构域结合，激活AC的活性提高cAMP的水平。此外，在低pH的环境下，CYR1的表达下调，菌丝生长缺陷，说明CYR1在白念珠菌适应不同pH环境中也发挥着作用[15]。

Srv2是一个AC相关蛋白，能够调节AC的活性，参与调控白念珠菌的形态转换等生理过程，SRV2在酿酒酵母中的同源基因是CAP1，SRV2缺失菌在小鼠系统性念珠菌感染模型中毒力丧失[16]，像通路中的其他突变体一样，SRV2缺失菌有形态转换缺陷，又可以通过添加cAMP或dbcAMP解救。有研究发现Srv2能够通过它的N-端和C-端分别连接Cyr1和G-actin，形成一个三聚体，在菌丝生长时起着激活cAMP合成的作用[17]。

在真核细胞中，G蛋白偶联受体能够调控多种信号通路，当其与配体结合后，本身构象发生改变激活效应蛋白，将信号传递至下游的效应器分子，包括腺苷酸环化酶和磷脂酶C[18]。

Gpr1是真菌细胞膜上的G蛋白偶联受体，由GPR1编码，在白念珠菌中其真正的配体是什么仍然存在争议，有研究认为是葡萄糖，也有研究认为是氨基酸尤其是甲硫氨酸发挥着与受体结合的作用[19]。在GPR1缺失菌中，Gα蛋白即Gpa2的组成性激活能够解救其在菌丝形成中的缺陷至与野生菌一致，说明GPR1在GPA2的上游发挥作用[11]，Gpa2是由GPA2基因编码的G蛋白α亚基，与Gpr1能够相互作用，Gpr1的C端连接Gpa2后，后者能够激活AC。在GPR1或者GPA2的缺失菌中，白念珠菌在固体培养基中菌丝形成和形态转换都有障碍，但是在液体培养基中并没有缺陷并且毒力保持完整[11,20]。此外，Ballou等[21]发现当白念珠菌暴露于乳酸中时，Gpr1能够帮助其掩蔽β-葡聚糖从而逃避免疫系统的检测。

3 Pde2和cAMP

cAMP是生物体内重要的第2信使分子，cAMP激活PKA (cAMP依赖性蛋白激酶)，使靶蛋白磷酸化，产生后续的效应，最后cAMP被磷酸二酯酶 (Pde)水解成5'-AMP而失活，发挥这一作用的主要是由PDE2编码的磷酸二酯酶2蛋白 (Pde2)。

Jung等[22]发现白念珠菌PDE2缺失菌表现出细胞壁和细胞膜性质改变相关表型，例如对膜干扰剂荧光素白和抗真菌药物氟胞嘧啶的敏感性增加，同时细胞壁组成成分中麦角甾醇和葡聚糖的含量也发生了改变，导致细胞壁厚度减少了大约25%。PDE2缺失菌对于营养缺失的敏感性显著升高，37℃下PDE2缺失菌在PBS中4 h后死亡超过50%，而野生菌超过90%依然存活[23]。另外PDE2缺失菌的体外黏附能力和侵袭能力也有所下降[24]。

在白念珠菌出芽过程中，PDE2的高表达能够拮抗SRV2激活的cAMP合成，抑制菌丝的生成，在PDE2缺失菌中，观察到了高水平的cAMP和菌丝的超常生长，但是超常菌丝生长的状态和无菌丝状态都是毒力缺失的[23]。

在琼脂培养基上，野生型菌株形成由出芽酵母构成的光滑菌落，而在同样的条件下，纯合的PDE2缺失菌表现出皱褶的菌落表型，褶皱的菌落由假菌丝和真菌丝混合而成[23]。综上，我们可以知道，Pde2对于调节细胞内cAMP水平是必不可少的，PDE2基因缺失后会导致细胞内cAMP无法降解以及PKA途径的持续性激活。

4 PKA和Bcy1

PKA又称cAMP依赖的蛋白激酶A，它的激活依赖于cAMP，当cAMP水平升高后，与PKA的调节亚基结合从而改变构象释放出催化亚基而激活PKA。白念珠菌中PKA的调节亚基由BCY1编码，催化亚基分别由TPK1和TPK2编码[25]。

在TPK2基因缺失后，细胞内的PKA活性显著下降，只有野生型的10%，说明PKA的活性主要由Tpk2发挥[26]。但是，Tpk1在白念珠菌细胞壁成分的调控中发挥着更重要的作用[27]。在TPK2缺失菌中，液体培养基菌丝的生长显著受阻而在固体培养基中菌丝形成的影响较小，菌株的毒力也部分下降，反之TPK2的过表达能诱导菌丝的生成并且促进琼脂侵袭[28]；与TPK2缺失菌相反，TPK1缺失菌在固体培养基中表现出菌丝生长的缺陷，而在液体培养基中菌丝形成只受到了轻微的影响[29]，造成这些差异的原因是两者的N-末端结构域的不同，在N-末端它们大约有80～90个氨基酸的组成不同，Tpk的N-末端结构域杂交实验表明琼脂的侵袭是由Tpk2的N-末端结构域介导的，但是Tpk1和Tpk2的催化域是高度同源的。

由于BCY1纯合子缺失菌不能存活，所以Cassola等构建了BCY1TPK2杂合缺失菌，缺失菌在GlcNac和血清诱导的条件下存在出芽缺陷。另外，通过Tpk1-GFP考察了野生菌、TPK2缺失菌和BCY1TPK2缺失菌细胞中Tpk1的定位，发现与野生菌、TPK2缺失菌中，Tpk1主要定位于细胞核中不同的是BCY1TPK2缺失菌中Tpk1分散于整个细胞中。另外，免疫共沉淀发现Bcy1与Tpk1-GFP有直接作用，说明Bcy1可能在PKA的催化亚基的细胞核定位中发挥重要的功能[30]。

5 Efg1和Flo8

多项证据表明Efg1是PKA的下游元件，TPK2的过表达不能恢复EFG1缺失菌的表型，而EFG1的过表达却能够回复TPK2基因缺失的菌丝生长缺陷；此外血清诱导的形态转换已知是由PKA途径介导的，而EFG1在这个过程中是不可或缺的[31-32]。Efg1作为该通路下游重要的转录因子，能够调节下游多种基因的表达，从而调控白念珠菌中菌丝形成、生物被膜生成等多种生物学功能。

Efg1是真菌特异性转录因子APSES (Asm1,Phd1,Sok2,Efg1,StuA)家族的成员，在形态转换以及能量代谢等许多不同的生物学过程中发挥着重要的作用[33]。APSES家族还包括构巢曲霉的StuA和粗糙脉孢菌中的Asm1，以及酿酒酵母中的Phd1和Sok2，所有APSES蛋白共享约100个氨基酸的高度保守的DNA结合结构域 (APSES结构域)，其中心结构域为典型的碱性螺旋-环-螺旋 (bHLH)结构[34]，在白念珠菌中，已经发现了两种APSES蛋白：Efg1和Efh1。

Efg1中央是碱性螺旋-环-螺旋 (bHLH)结构域，其侧翼是在真菌APSES蛋白中高度保守的序列，在N-和C-末端有多聚谷氨酰胺的延伸。Efg1的APSES域是真菌菌丝形态发生中必需的，而bHLH侧翼序列是维持Efg1稳定所必不可少的。Flo8转录因子与Efg1的结合不依赖于APSES结构域，而Efg1与MluI细胞周期盒 (MCB)元件结合仅需要APSES结构域。这表明Efg1的功能域包括参与DNA结合的APSES结构域，以及同各种蛋白质相互作用和调节活性所需的侧翼区[35]。

EFG1缺失菌在许多诱导条件下菌丝生长缺陷[36]，在液体或固体培养基中添加血清或GlcNAc诱导菌丝形成被完全阻断，相比之下，在微需氧或包埋条件下，EFG1基因缺失菌菌丝形成不受影响，甚至可能促进菌丝的生长[37]。这些结果表明，在不同的条件下，Efg1既可以发挥促进菌丝形成的作用，也能抑制这一过程。

Efg1的DNA结合域可以与菌丝特异基因HYR1、HGC1和ECE1等相结合，并且介导它们与菌丝特异性Swi/Snf复合物的结合，从而实现靶基因在菌丝生成期间的转录激活[38]。另外，Efg1通过调节细胞壁相关蛋白基因 (如HWP1、ALS3)的表达来调节细胞表面特性。Hwp1在白念珠菌细胞间相互作用以及生物膜形成中十分重要的，在白念珠菌黏附于上皮细胞的过程中也是必不可少的[39]；Als3是白念珠菌黏附到多种宿主细胞表面蛋白所必需的，包括内皮细胞上的N-钙粘蛋白和口腔上皮细胞上的E-钙粘蛋白[40]。Efg1还参与了白念珠菌的代谢，在糖酵解中发挥着作用，在EFG1缺失菌中，糖酵解相关基因如FBA1、PFK1和ENO1等转录水平下降[41]。Efg1还负责调控天冬氨酸蛋白酶家族SAP3、SAP5等的表达，在EFG1缺失菌中，SAP3和SAP5表达量明显降低，菌株毒力下降[42]，天冬氨酸蛋白酶是白念珠菌分泌的关键毒力因子，表明Ras/cAMP/PKA信号通路在毒力因子的控制中也发挥着重要的作用。

Flo8是一个含有LisH结构域的转录因子，是RAS/cAMP/PKA通路下游的调节因子，通过影响白念珠菌形态转换从而影响其致病性和毒力[43-44]，在生物被膜的形成中也发挥重要的作用[45]。

白念珠菌中FLO8的缺失完全阻断菌丝形成和菌丝相关基因的表达，并导致系统性念珠菌病模型中毒力的丧失。FLO8和EFG1缺失菌的全基因组转录分析表明，Flo8特异性调节Efg1调节基因的子集，主要是菌丝特异性基因，提示Flo8可能在Efg1的下游发生作用，另外免疫共沉淀实验表明Flo8与Efg1有直接的相互作用，这些结果提示我们Efg1/Flo8复合物可能调控着众多RAS/cAMP/PKA通路相关基因的表达，如HWP1、HYR1、ECE1、ALS3、IHD1、SAP5和HGC1等[46]。此外，Du等[47]的研究表明Flo8在CO2诱导的灰白转换以及菌丝生长中扮演着关键的角色，并且Flo8的异位表达能够显著提高白念珠菌对CO2的敏感性。

RAS/cAMP/PKA信号通路在白念珠菌中发挥着十分广泛且重要的作用，在白念珠菌的生存以及对宿主的感染中都扮演着举足轻重的角色，对于形态转换、黏附、侵袭、代谢、耐药、应激反应和毒力都是不可或缺的。该通路还有许多新的未知功能的基因等待着被发掘研究，对这些基因功能的探索将会帮助我们了解RAS/cAMP/PKA通路的调控及分子机制。随着白念珠菌中一些重要的毒力因子和信号转导通路被阐释清楚，其中一些基因或者蛋白未来或许能够成为研发新的抗真菌药物的靶点。

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[本文编辑] 卫凤莲

上海市自然科学基金 (17ZR1437700)；国家自然科学基金 (81470158，81330083)

鲁仁义，男 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:15821695738@163.com

姜远英,E-mail:13761571578@163.com;阎澜,E-mail:ylan20001228@sina.com

R 379.4

B

1673-3827(2017)12-0052-06

2017-01-12