结核分枝杆菌在不同pH值液体培养基中对吡嗪酰胺敏感度的研究

郑惠文 逄宇 赵雁林

·论著·

结核分枝杆菌在不同pH值液体培养基中对吡嗪酰胺敏感度的研究

郑惠文 逄宇 赵雁林

目的 研究结核分枝杆菌在不同pH值液体培养基中对吡嗪酰胺(PZA)敏感度的影响，同时比较不同pH值下结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的敏感度与测序结果的一致率，探讨最适合对吡嗪酰胺进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)的pH值。方法 本研究采用简单随机抽样法中的直接抽选法，从2007年全国结核病耐药性基线调查的3929株结核分枝杆菌菌株中抽取348株；采用BACTEC MGIT 960系统在液体培养基pH值为 5.3、5.5、5.7、5.9和6.1时，分别检测结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的敏感度；同时对吡嗪酰胺耐药的结核分枝杆菌相关基因pncA和rpsA进行测序，分析其突变特征；采用卡方检验统计2种方法检测吡嗪酰胺耐药率的差别，以P<0.05为差异有统计学意义。结果 在348株结核分枝杆菌中，用MGITTM960 PZA试剂盒(pH值为5.9)检测的吡嗪酰胺总耐药率为14.4% (50/348)，DNA测序结果有43株耐药，其中有30(69.8%)株检测到吡嗪酰胺药物耐药相关基因pncA发生突变， 1株(2.3%)耐药分离株仅在rpsA有突变。在液体培养基pH值为6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3时，DNA测序结果与所有菌株表型药敏试验结果的一致率分别为94.8% (330/348)、95.1% (331/348)、 96.8% (337/348)、 95.2% (316/332) 和 93.5% (287/307)。并且pH值为5.7时2种方法的耐药一致率(92.1%，35/38)明显高于pH值为5.9(76.0%， 38/50)时(χ2=3.961,P=0.047)；而pH值为6.1 (72.7%，40/55)、pH值为5.5(93.3%，28/30)和pH值为5.3(95.0%， 19/20)时的耐药一致率与pH值为5.9时的耐药一致率相比，差异无统计学意义(χ2=0.147,P=0.702；χ2=0.366,P=0.545；χ2=3.410,P=0.065)。结论 液体培养基pH值为5.7时，结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药与遗传突变检测结果有较好的相关性。

分枝杆菌，结核； 吡嗪酰胺； 培养基, 条件性； DNA突变分析； 抗药性； 判别分析

结核病是全世界重要的公共卫生问题之一。据WHO估计，2015年全球约有104万例新发结核病患者，140万例死于结核病，中国的新发结核病患者例数仅次于印度和印度尼西亚而位居全球第三位[1]。吡嗪酰胺(PZA)是重要的一线抗结核药物，可在酸性环境中杀死半休眠状态的结核分枝杆菌，使化疗疗程从既往的9～12个月缩短至6个月[2]。在酸性环境中(pH=5.5)，PZA能够转化为吡嗪酸(pyrozinoic acid，POA)，发挥杀菌活性[3]。WHO 推荐采用BACTEC MGIT 960系统(简称“MGIT 960系统”)在酸性环境中(pH=5.9)检测结核分枝杆菌对PZA的敏感度[4]，但不同的pH值将影响吡嗪酰胺酶(pyrazanamidase, PZase)的活性，从而可能对结核分枝杆菌产生不同的抑制作用。此外，编码吡嗪酰胺酶的基因pncA和编码核糖体蛋白质S1的基因rpsA突变也与结核分枝杆菌PZA耐药有关[5]。因此，笔者采用MGIT 960系统，检测液体培养基不同pH值情况下结核分枝杆菌对PZA敏感度的影响，并与DNA测序表型药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果进行比较，探讨最适合进行PZA药敏试验的液体培养基pH值。

材料和方法

一、菌株来源

本实验采用简单随机抽样法中的直接抽选法，从3929株来自于2007年全国结核病耐药性基线调查的菌株中抽取348株，菌株由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。348株菌株经对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)菌种鉴定实验证实为结核分枝杆菌复合群(MTBC)。

二、试剂来源

本实验所用改良罗氏培养基购于珠海贝索生物技术有限公司； MGITTM960 PZA试剂盒购于美国BD公司(货号245128，批号4199861，效期2016年11月26日)；2×Taq 预混液购自北京康为世纪生物科技有限公司；所有引物均由北京擎科生物技术有限公司合成。

三、PZA药敏试验

采用WHO推荐的MGIT 960系统进行药敏试验。将结核分枝杆菌阳性培养物制备成1 mg/ml 菌悬液，稀释至106菌落形成单位(CFU)/ml，取0.5 ml菌悬液加入进行PZA药敏试验专用的MGIT培养管中(药物浓度100 μg/ml)，将菌悬液1∶10稀释后加入不含PZA的培养管中，作为生长对照管。采用结核分枝杆菌标准菌株H37Rv(ATCC 27249)作为质控菌株。此外，用磷酸将液体培养基的pH值 (5.9)调节到5.3、5.5和5.7，用碳酸氢钠将液体培养基pH值调到6.1。液体培养基的pH值用pH计进行检测。然后置于MGIT 960系统中，根据分枝杆菌生长情况比对自动报告药物敏感度结果。

四、基因组DNA提取

采用简单水煮法提取MTB基因组DNA，使用接种环从改良罗氏培养基斜面刮取MTB菌落，将菌落转移至含有1 ml生理盐水的无菌Eppendorf 离心管中，85 ℃ 30 min灭活，12 000×g离心5 min，弃上清。菌体用500 μl TE (Tris-EDTA) 缓冲液(pH=8.0)充分悬浮，100 ℃沸水浴30 min，12 000×g离心5 min，将上清转移至无菌离心管中用于基因扩增模板。

五、基因扩增和测序

扩增对PZA耐药的相关基因pncA和rpsA， 引物序列分别为F1，5′-TGCCACTCGCCGGTAACCGG-3；F2，5′-GGTGGCCGCCGCTCAGCTGG-3′，用于扩增pncA全基因；F3，5′-GGCCGCAGCTG-GGACGCGGC-3′； F4， 5′-CGGTCCAGCGCTCC-GTCTGC-3′，用于扩增rpsA全基因。扩增体系如下：2×Taq 预混液25 μl， 上游引物0.2 μmol， 下游引物0.2 μmol，基因组DNA 5 μl，使用双蒸水(ddH2O)补平到总体积50 μl。PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min， 58 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min， 35个循环；72 ℃延伸10 min。基因扩增产物送北京擎科生物技术有限公司测序。测序结果采用BioEdit 软件与标准株H37Rv基因序列进行比对。

六、统计学分析

采用SPSS 11.5 软件进行统计学分析，药物敏感性结果与测序结果一致率之间的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、pncA和rpsA突变结果分析

348株MTBC中，220株(63.2%)为敏感株，128株(36.8%)为耐药菌株，其中MDR 33株，XDR 2株(表1)。MGITTM960 PZA试剂盒(pH=5.9)检测的50株PZA耐药株中，测序结果有43株耐药，其中30株pncA发生突变，突变率达69.8%(30/43)。其中23株(76.7%)为氨基酸替换突变，6株(20.0%)为碱基插入或缺失引起的氨基酸移码突变，1株(1/30)在启动子区-11位碱基发生A→C突变。除了pncA基因外，1株(2.3%)PZA耐药分离株仅在rpsA有突变。此外，1株PZA敏感株分别在pncA的40位密码子和rpsA的497位密码子检测出突变(表2)。

表1 不同耐药类型在348株结核分枝杆菌分离菌株中的分布及耐药率

注 H：异烟肼；R：利福平；E：乙胺丁醇；S：链霉素；Ofx：氧氟沙星；Km：卡那霉素；MDR：耐多药；XDR：广泛耐药

二、不同pH值液体培养基的药敏试验结果比较

在液体培养基的pH值为5.5和5.3时，分别有16株(4.6%)和41株(11.8%)在对照管中没有生长。在液体培养基的pH值为6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3时，PZA表型耐药分离株分别占有药敏试验结果菌株的15.8% (55/348)、14.4% (50/348)、10.9% (38/348)、9.0%(30/332)和6.5%(20/307)。统计学分析表明，表型耐药与基因型耐药的一致率在培养基的pH值为 5.9时和pH值为6.1时分别为76.0% (38/50)、72.7% (40/55)，差异无统计学

表2 对PZA耐药结核分枝杆菌的pncA和rpsA基因突变情况

注a：启动子区无氨基酸变化

意义(χ2=0.147,P=0.702)。在培养基的pH值为 5.7时，表型耐药与基因型耐药药敏试验结果的一致率明显高于pH值为 5.9时，耐药一致率分别为92.1% (35/38)、76.0%(38/50)，差异具有统计学意义(χ2=3.961,P=0.047)。同样，pH 值为5.5时的耐药一致率(93.3%)明显高于pH值为 5.9时，差异具有统计学意义(χ2=3.902,P=0.048)。与DNA测序结果相比，表型药敏试验结果的一致率在pH值为6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3时分别为94.8%(330/348)、95.1%(331/348)、 96.8%(337/348)、 95.2%(316/332) 和 93.5%(287/307)，并且在pH值为5.9时的一致率明显低于pH值为5.7时，差异具有统计学意义(χ2=5.441,P=0.020)(表3)。

表3 对PZA进行表型药敏试验的结果与pncA或rpsA基因突变测序结果的一致率

注 一致率以表型药敏试验结果作为标准

讨 论

PZA可以杀死半休眠状态的结核分枝杆菌，是结核病短程化疗方案的重要组成药物。研究发现，PZA只有在体外酸性环境中或巨噬细胞中才能发挥抗结核分枝杆菌作用，它进入体内后，通过吡嗪酰胺酶转化为吡嗪酸实现杀菌作用。然而由于PZA体外实验对培养条件的特殊要求，改良罗氏培养法尚不能检测PZA耐药性[6]。MGIT 960系统是WHO推荐的液体药敏试验检测系统，在液体培养基pH值为5.9时可用于对PZA的体外敏感度检测，但该酸度并不能使吡嗪酰胺酶的活性发挥最大，超过10%的分枝杆菌在pH值为5.5时不能生长，而此时PZA在体外的活性最大[7-8]。因此，寻找适合细菌生长和酶活性的pH值至关重要。笔者研究发现液体培养基酸度越大，对PZA耐药的比例越低。说明低pH值更有利于吡嗪酰胺酶发挥活性，将PZA转化为吡嗪酸，从而抑制结核分枝杆菌生长。研究表明，部分菌株、尤其是PZA耐药菌株在pH值低于5.5的酸性环境中不能生长[9]。与之前研究类似[9-10]，笔者发现在pH值为5.3时，11.8%的结核分枝杆菌不能生长；而pH高于5.7时，结核分枝杆菌的生长并未受到抑制，表明该pH值是结核分枝杆菌存活的上限。

结核分枝杆菌编码吡嗪酰胺酶的pncA基因发生突变，导致该酶活性下降，是结核分枝杆菌对PZA耐药的主要原因[11]。Chang等[12]分析表明，平均87%的对PZA耐药的菌株中pncA基因发生突变。而本研究中只有69.8%的对PZA耐药的菌株出现pncA突变，与国外报道的69%～98.8%突变率相似[13-15]。这种不同可能是由于MGIT960系统本身造成的假阳性结果，包括培养基的pH值、抗生素浓度和接种量[16]。当培养基的pH值调到5.7时，MGIT 960系统检测的结核分枝杆菌对PZA的耐药与基因测序有较好的相关性。由于pH值为 5.9时，MGIT 960检测系统可能产生较多的假阳性PZA耐药株，因此将培养基的pH值降到理想的水平是至关重要的。

综上所述，遗传突变与液体培养基pH 值为5.7时的PZA耐药有较好的相关性。在对PZA进行体外药敏试验中，液体培养基pH 值为5.7或许是调节吡嗪酰胺酶活性和结核分枝杆菌生长的理想阈值。

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(本文编辑：范永德)

The effect of pH on the pyrazinamide susceptibility ofMycobacteriumtuberculosis

ZHENGHui-wen*,PANGYu,ZHAOYan-lin.

*NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the effect of pH on the pyrazinamide (PZA) susceptibility ofMycobac-teriumtuberculosisstrains in the BACTEC MGIT 960 liquid medium, to demonstrate the relationship between phenotype susceptibility and genetic changes amongM.tuberculosisisolates, and to determine the most suitable pH value for evaluating pyrazinamide susceptibility. Methods A total of 348 isolates were randomly selected from those collected during the national drug resistance baseline survey conducted in 2007, and the PZA susceptibility of eachM.tuberculosisisolate was detected using the BACTEC MGIT 960 automated system at pH 5.3, 5.5, 5.7, 5.9 and 6.1. ThepncAandrpsAgenes from all isolates were sequenced for genetic mutations conferring PZA resistance. The concordance rate between phenotypic DST in different pH environments and genetic changes was evaluated using the Chi-square test,P<0.05 being considered statistically significant. Results Of the 348M.tuberculosisisolates, 50 (14.4%) isolates resistant to PZA were detected using a commercial BACTEC MGIT 960 PZA kit at pH 5.9, and 43 using DNA sequencing, 30 (69.8%) isolates harboringpncAmutations, and 1 (2.3%) isolate harboring mutations only inrpsA. The overall concordance rate between DNA sequencing and phenotypic DST results at different pH values was 94.8% (330/348), 95.1% (331/348), 96.8% (337/348), 95.2% (316/332) and 93.5% (287/307) at pH 6.1, pH 5.9, pH 5.7, pH 5.5 and pH 5.3, respectively. The difference between the pH 5.9 and pH 5.7 groups was statistically significant (χ2=3.961,P=0.047), but that between the pH 6.1, pH 5.5, pH 5.3 and pH 5.9 groups (χ2=0.147,P=0.702；χ2=0.366,P=0.545；χ2=3.410,P=0.065, respectively) was not statistically significant. Conclusion The strongest correlation between genetic changes inM.tuberculosisisolates and PZA resistance was obtained using liquid culture at pH 5.7. Using a pH 5.7 liquid medium may be the best approach to resolve the dilemma between PZase activity and mycobacterial growth during PZA susceptibility testing.

Mycobacteriumtuberculosis; Pyrazinamide; Culture media, conditioned; DNA mutational analysis; Drug resistance; Discriminant analysis

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.009

“十二五”国家科技重大专项(2014ZX100030002)

102206 北京，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所(郑惠文),结核病预防控制中心(逄宇、赵雁林)

赵雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2016-11-21)