果胶酶辅助提取仙人掌总皂苷的工艺研究*

郑林禄，陈 敏，魏 芬，阮俊峰，韩 莹，王双花

[1.宁德师范学院 化学系，福建 宁德 352100；2.福建省特色生物化工材料重点实验室，福建 宁德 352100；3.福建省生态产业绿色技术重点实验室(武夷学院)，福建 南平 354300；4.宁德师范学院 生物系，福建 宁德 352100]

仙人掌皂苷是仙人掌中含治疗功效成分中的一种重要生物活性成分，主要以齐墩果酸型三萜类皂苷为主，具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化和消炎止痛等独特生理功能[1-4]。将其配制成药内服，可达到祛痰、止咳、平喘的功效。此外，通过对三萜皂苷的结构和药理分析显示其还具有提高机体免疫能力、强心活血、提高应激能力和机体兴奋性的功效[5-7]。

对于仙人掌总皂苷的提取，研究者们一直在不断探索研究中。韩本勇等人[8-9]采用有机溶剂法从仙人掌中提取皂苷化合物。有机溶剂提取法主要存在的问题是采用的多数有机溶剂有毒、易挥发，而微波处理和超声波提取无形中又增加成本，大孔吸附树脂法浓缩时可能导致部分皂苷析出损失。近年来研究者发现酶解法可降低能耗，缩短提取时间，提高目标物质的提取率，且避免了挥发性有机物的使用，安全环保[10-15]。基于果胶酶可以发生酶解反应快速除去果胶物质，有效地破坏植物的细胞壁，能够更方便快捷的使皂苷溶解出来，故采用果胶酶辅助提取仙人掌总皂苷。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

果胶酶：食品级，南宁庞博生物工程有限公司；仙人掌粉：聚杰中药有限公司；甲醇：化学纯，乙醇、正丁醇、香草醛等试剂均为分析纯，天津市致远化学试剂有限公司。

紫外-可见分光光度计：UV-2100，北京瑞利分析仪器公司；循环水式多用真空泵：SHZ-D(III)，河南省予华仪器有限公司；超级恒温水浴及机械搅拌器：HH-501，金坛市杰瑞尔电器有限公司。

1.2 实验方法

准确称取一定量的仙人掌粉末，添加适量果胶酶、调节酶解温度和溶液pH值提取总皂苷，提取液通过石油醚除杂，水饱和正丁醇萃取，再利用香草醛-冰醋酸显色，以齐墩果酸标准品溶液为对照品，通过紫外-可见分光光度法测定仙人掌中总皂苷的含量。在单因素实验(pH值、酶添加量、酶解温度和酶解时间)的基础上，采用L9(34)正交实验，得出仙人掌总皂苷的最佳提取条件；按照最佳提取工艺条件，进行重复性验证实验，计算仙人掌总皂苷提取率[16]。

1.3 仙人掌总皂苷提取率的测定

仙人掌总皂苷提取率按如下公式计算。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

采用紫外-可见分光光度计，以齐墩果酸标准品为对照品，确定仙人掌总皂苷的最大吸收波长为547 nm，

以吸光度A为纵坐标，以标准品溶液的质量浓度ρ为横坐标，绘制标准曲线(见图1)。得到回归方程为y=19.367x+0.035 5，R2=0.994 6。说明标准品溶液的质量浓度在0～0.10 mg/mL与吸光度A具有良好的线性关系。

ρ/(mg·mL-1)图1 齐墩果酸对照品标准溶液的标准曲线图

2.2 单因素实验结果分析

2.2.1 最佳pH值的选择

准确称取5.00 g干燥的仙人掌粉末5份，加入0.030 g果胶酶和体积分数70%乙醇，[m(仙人掌粉末)∶V(乙醇)(g/mL，以下简称料液比)为1∶10，下同]，调节pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，温度为45 ℃，水浴酶解1.0 h后转入95 ℃水浴加热5 min，将提取后的溶液过滤，加入显色剂和氧化剂并定容，研究pH值对仙人掌总皂苷提取率的影响，结果见图2。

pH图2 不同pH值对仙人掌总皂苷提取率的影响

由图2可见，pH值对仙人掌总皂苷的提取率有一定的影响，pH=3.5～4.5时，随着pH值升高总皂苷的提取率也升高。当pH>4.5时，随着pH值升高总皂苷的提取率反而减少，pH=4.5时总皂苷的提取率最大，故最佳的提取pH=4.5。

实验结果分析：pH值影响着仙人掌提取液中被吸附物的吸附位点和理化性质，因此pH值对仙人掌中总皂苷的提取有一定程度的影响，因为仙人掌皂苷是天然弱酸性皂苷元，在弱酸性的条件下，其吸附性能好而且溶解度高。

2.2.2 最佳酶添加量的选择

准确称取5.00 g干燥的仙人掌粉末5份，分别加入0.020、0.030、0.040、0.050、0.060 g果胶酶和料液比1∶10的体积分数70%乙醇，调节pH=4.5，温度为45 ℃，水浴酶解1.0 h后转入95 ℃水浴加热5 min，加入显色剂和氧化剂并定容，研究酶添加量对仙人掌总皂苷提取率的影响，结果见图3。

m(酶)/g图3 酶添加量对仙人掌总皂苷提取率的影响

由图3可见，m(酶)=0.020～0.040 g时，随着酶添加量的增加，总皂苷的提取率也随之升高，当m(酶)=0.040 g时，总皂苷的提取率最大，当m(酶)>0.040 g时，总皂苷的提取率反而减少，故最佳酶添加量为0.040 g。

实验结果分析：一定量果胶酶的加入，改变仙人掌细胞壁的通透性，使得皂苷流露出来，增加提取率，但当继续添加果胶酶，反而抑制酶的作用，使得提取率下降，另外果胶酶含有竞争性抑制因子，也会抑制底物与酶的结合。

2.2.3 最佳酶解温度的选择

准确称取5.00 g干燥的仙人掌粉末5份，加入0.030 g果胶酶和料液比1∶10的体积分数70%乙醇，调节pH=4.5，温度分别为40、45、50、55、60 ℃，水浴酶解1.0 h后转入95 ℃水浴加热5 min，加入显色剂和氧化剂并定容，研究酶解温度对仙人掌总皂苷提取率的影响，结果见图4。

酶解温度/℃图4 酶解温度对仙人掌总皂苷提取率的影响

由图4可见，当酶解温度在40～55 ℃时，随着温度的升高总皂苷的提取率也升高，当酶解温度升高到55 ℃时，总皂苷的提取率达到最大值，当温度大于55 ℃时，总皂苷的提取率反而减少，故最佳的酶解温度为55 ℃。

实验结果分析：酶解温度升高可能会导致分子剧烈运动，从而使分子扩散速度加快，促使皂苷快速溶解出来，使得皂苷的提取率提高。但是如果温度过高，就会导致酶的活性成分被破坏，从而导致仙人掌总皂苷提取率减小。

2.2.4 最佳酶解时间的选择

准确称取5.00 g干燥的粉末5份，加入0.030 g果胶酶和料液比1∶10的体积分数70%乙醇，调节pH=4.5，温度为45 ℃，水浴酶解时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后转入95 ℃水浴加热5 min，加入显色剂和氧化剂并定容，研究酶解时间对仙人掌总皂苷提取率的影响，结果见图5。

酶解时间/h图5 酶解时间对仙人掌总皂苷提取率的影响

由图5可见，酶解时间对仙人掌总皂苷的提取有一定的影响，随着酶解时间的延长总皂苷的提取率升高，当酶解时间达到2.5 h时，总皂苷的提取率达到最大值，而当酶解时间继续延长时总皂苷的提取率并没有提高而趋于平稳，故最佳的酶解时间为2.5 h。

实验结果分析：随着酶解时间的延长，仙人掌总皂苷提取率先快速增加，后趋于平稳，原因可能是随着时间的加长，仙人掌逐渐酶解反应完全，所以再延长时间提取率并没有提高。

2.3 正交实验优化结果分析

为进一步优化果胶酶解法提取仙人掌总皂苷的工艺参数，在单因素实验的基础上，以皂苷提取率为考察指标，采用L9(34)安排正交实验，选取pH值(A)、酶的添加量(B)、酶解温度(C)、酶解时间(D)四个因素，正交实验因素水平表见表1。

表1 仙人掌总皂苷提取正交实验因素水平表

采用紫外-可见分光光度法测定总皂苷含量，通过L9(34) 正交实验优选出总皂苷的提取工艺，实验分析结果见表2。

表2 正交实验结果表

由表2可知，影响仙人掌中总皂苷的提取率的因素主次顺序为：B>A>C>D。最佳的提取条件为B2A2C2D1，即酶添加量为0.040 g，pH=4.5，酶解温度为55 ℃，酶解时间为2.0 h。

2.4 工艺验证实验

称取仙人掌粉末50.02 g，根据正交实验得到的最佳提取工艺条件进行验证实验。测得提取物中m(总皂苷)=0.091 3 g，总皂苷的提取率为0.182 5%。文献报道韩本勇等人[8]直接采用乙醇提取仙人掌总皂苷，与本实验采用果胶酶酶解法提取仙人掌总皂苷进行对比实验，结果见表3。表3结果表明，采用果胶酶辅助提取仙人掌中总皂苷工艺不仅可缩短提取时间，而且可有效提高总皂苷的提取率。

表3 两种提取方法的比较

3 结 论

基于酶具有高效性和特异性，酶解法不仅可降低提取成本，提高提取率，而且安全环保。本实验采用果胶酶辅助乙醇提取法，在单因素实验的基础上，采用L9(34)正交实验，实验结果得出果胶酶辅助提取仙人掌总皂苷的最佳提取工艺条件为m(酶)∶m(仙人掌粉末)=1∶125，pH=4.5，酶解温度55 ℃，酶解时间为2.0 h，在该条件下仙人掌中总皂苷的提取率为0.182 5%。与单纯乙醇提取法相比，果胶酶辅助提取法可有效缩短提取时间，提高总皂苷的提取率。

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