雷公藤抗氧化酶对福木假尾孢菌毒素侵染的响应

张祖权

（福建省沙县水南国有林场，福建 沙县 365050）

雷公藤(Tripterygium Wilfordii)是一种著名中药，又叫黄藤、黄腊藤、菜虫药、红药、水莽草，为卫矛科植物，主产于福建、浙江、安徽、河南等地。原植物生于背阴多湿的山坡、山谷、溪边灌木丛中，喜较为阴凉的山坡，以偏酸性、肥沃、土层深厚的砂质土或黄壤土最宜生长，已有几百年的入药记录[1,2]。现代临床及药理学研究表明，雷公藤具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节及抗生育等作用[3-7]，为临床治疗类风湿或风湿性关节炎的常用中药。

然而，雷公藤药用成分含量极低，加之野生资源蕴藏量少，人工栽培又存在生长缓慢、收获期长的问题，无法满足市场需求，成为中国珍贵紧缺中药材。因此，加快对雷公藤的开发与利用已经成为当前生产亟需解决的问题。由于雷公藤野生资源的缺乏，大面积推广种植雷公藤，使得原本在野生资源中就普遍存在的病害——雷公藤角斑病更加猖獗，致使大量叶片提前脱落，给农户造成了巨大的经济损失。虽然近年来国内外学者对雷公藤做了大量的研究[13-14]，但对于角斑病的研究却非常少，刘锡琎等[15]在湖南长沙的雷公藤病叶上发现一种致病菌福木假尾孢（Pseudocercospora elaeodendri），但目前对雷公藤抗福木假尾孢菌毒素侵染的研究还比较匮乏。

在病原菌或致病因子等外界胁迫条件下，植物往往启动一些防御反应酶。其中POD广泛分布于植物体内，它可以催化植物体内许多化合物如脂肪酸、酚类物质等的氧化反应，同时还参与乙烯的生物合成等生理活动[16]。因此，POD活性的变化关系到植物体内其它生理生化反应的变化。有研究结果表明，POD的活性与植物抗病性呈正相关，即POD的活性越高，植物的抗病性越强[17-18]。且POD与SOD共同组成细胞内清除活性氧伤害的保护酶系统，在阻止或减少羟基自由基形成方面起重要作用。有鉴于此，本研究通过测定在福木假尾孢菌毒素中培养不同时间的雷公藤幼梢健康叶片SOD、POD的活性变化，观察植物组织中保护酶抵抗毒素的过程，为雷公藤进一步的开发与利用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 研究材料

试验所用的雷公藤材料取材于三明市泰宁县林业局泰宁县杉阳公司，通过扦插移植于福建农林大学田间实验室。取福建农林大学田间实验室刚长出的幼嫩雷公藤枝条若干，通过培养取其叶片待用。

取福建农林大学田间实验室中培养的带病雷公藤植株的病叶，通过分离及进一步纯化得到福木假尾孢菌。

1.2 研究方法

1.2.1 雷公藤假尾孢菌毒素培养与含毒滤液的提取

将福木假尾孢菌菌种接种到PSA培养基上，29℃培养15 d，转入查彼培养液中，每瓶接7个菌饼（直径为6 mm）。在恒温29℃的摇床中暗培养25 d。将所得菌液先用双层纱布过滤，再用双层滤纸过滤，滤液5 000 r/min下离心18min，上清液即为含毒滤液。将含毒滤液在45℃低压旋转蒸发为原体积的1/10，在5 000 r/min下离心18min，取上清液，进行无菌过滤，得到的即为雷公藤假尾孢菌的粗毒素。

1.2.2 取样

将雷公藤幼梢插入装有60 mL毒素液的广口瓶中，使基部约3 cm浸在提取的毒素液中，每瓶放置10苗，每处理重复3次，并以清水为对照。处理的枝条置于室温（23±5℃）下观察。经毒素处理后，分别于12、24、36、48、60 h取枝条上的叶片进行测定。

1.2.3 酶液提取

称取0.5 g雷公藤叶片，放入冰浴的研钵中，加入预冷 （4℃）POD提取介质0.05 mol/L pH值 7.0的PBS（磷酸缓冲液）5 mL（先加3 mL，再加1 mL冲洗，最后再用1mL冲洗，冲洗液一并转入离心管中）。将雷公藤叶片研磨成匀浆，在12 000 r/min，4℃下离心15min，取上清液备用。

1.2.4 SOD活性的测定

依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。3mL反应混合液含有：2.0 μmol·L-1核黄素、75 μmol·L-1NBT、10 μmol·L-1EDTA-Na2、13mmol·L-1甲硫氨酸 （Met）、0.05mol·L-1pH值7.8磷酸缓冲液。加适量酶液后在4 000 lx下反应10min，并在560 nm下测定光密度，以缓冲液代替酶液作空白，SOD以抑制NBT光化还原50%为一个酶单位。以每分钟抑制NBT为氧化还原50%酶用量为一个酶活性单位：SOD 总活性＝（Ack-A）Vt/（0.5 AckWVt），其中Ack为照光对照管的吸光度，A样品管的吸光度，V为样品液总体积，Vt为测定时样品用量，W为样品鲜重。

1.2.5 POD活性的测定

过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470 nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。

取10 uL酶液，加入1mL 0.1M pH值6.0的PBS和3mL POD反应混合液，立即于470 nm处比色，每隔一分钟记录一次吸光度值，共测3次。按POD活性=（⊿A470×酶液总体积）/（测定时取酶液的量×样品鲜重×反应时间）计算酶的相对活性。

2 结果与分析

2.1 毒素粗提取物处理对雷公藤体内SOD活性的影响

从图1中我们可以看出两条曲线都是呈先增后降的变化趋势，毒素处理24 h后SOD活性极显著高于对照21%，首先达到了高峰。且24 h以前毒素处理的雷公藤SOD活性升高的速度也明显大于对照。但24 h以后，毒素对SOD抑制作用加强。SOD活性下降，但48 h后酶活性又开始回升，到60 h的酶活性值高于初始值10%，比对照高出22%。这表明雷公藤受毒素侵染后植物机体首先表现出抵抗的效果，酶活性升高，但可能由于毒素毒性过强，难以抵制，活性逐步下降，但随着机体SOD大量表达，48 h后酶活性又开始回升，到60 h的酶活性值高于初始值，表明SOD对毒素侵染有抵抗能力。因此，SOD可以作为雷公藤抗角斑病的生理指标。

2.2 毒素粗提取物处理对雷公藤体内POD活性的影响

从图2可以看出毒素促进了植物体内的过氧化物酶的表达，60 h内毒素处理的雷公藤植物的POD活性都高于对照的枝条。12 h毒素处理的雷公藤高于对照7%，24 h毒素处理的雷公藤高于对照28%，36 h毒素处理的雷公藤高于对照20%，48h毒素处理的雷公藤高于对照15%，12 h毒素处理的雷公藤高于对照34%。12～24 h毒素处理的雷公藤植株的POD活性的升高速度高于对照处理的植株；24～36 h二者的增长幅度相差不大，36 h时，二者都出现了峰值，36 h后POD活性下降，但48h后毒素处理的植株POD活性上升，而对照的POD活性基本稳定；这表明雷公藤受毒素侵染后植物机体首先表现出抵抗的效果，酶活性升高，但可能由于毒素毒性过强，难以抵制，活性逐步下降，但随着机体POD大量表达，48 h后酶活性又开始回升，到60 h的酶活性值高于初始值，表明POD对毒素侵染有抵抗能力。因此，POD可以作为雷公藤抗角斑病的生理指标。

图1 不同处理的雷公藤SOD活性变化Figure 1 Different treatment Tripterygium wilfordii SOD changes

图2 不同处理的雷公藤POD活性变化Figure 2 different treatment Tripterygium w ilfordii POD activity changes

3 结论与讨论

植物的抗病能力由体内的抗病基因决定，这些基因的表达速度、程度以及基因表达所产生的抗菌物质量的多少都与抗病能力有直接的关系。大量研究表明，植物受病原菌侵染后过氧化物酶和多酚氧化酶的活性有较大的变化，其变化与植物的抗病性密切相关[19-22]。植物与病原菌相互作用过程中广泛存在着活性氧爆发现象引发的体内多种氧化反应，这种现象被看做是植物防卫反应机制的一部分。正常情况下，植物体内代谢保持平衡，而在逆境下，植物将产生大量的活性氧，过量的活性氧可导致蛋白质、膜脂、DNA及其他组分的严重损伤，甚至死亡[23-24]。

通过对雷公藤毒素处理，按照不同时间进行取样，从叶片中超氧化物歧化酶、过氧化物酶的指标上进行测定分析。由于本试验毒素处理的雷公藤植株在60 h之后已接近死亡，故不再对其酶活性进行测定。测量SOD所得数据均与各时间段雷公藤的抗病性相对应，由于受到病菌毒素的侵染导致植物的酶活性提高，而后期由于毒性过强植物难以抵抗，SOD活性开始下降，从48 h这个转折点来看，植物中SOD活性开始升高，这表明植物对病菌的侵染做出了抵抗。且整个实验过程毒素处理的雷公藤植株POD活性都高于对照水平，这也表明植物对病菌的侵染作出了抵抗。从图1及图2上可以看出SOD的最大值出现在24 h，而POD的最值出现在36 h，这证明了植物组织对活性氧的清除过程中SOD先行于POD，验证了SOD能将O2-转化为毒性较小的H2O2和O2，而POD又可进一步清除H2O2生成无害的H2O和O2，两种酶协同作用完成了对植物体的保护。试验表明SOD、POD都可以作为雷公藤植株抗性的指标。说明用毒素粗提物处理枝条来鉴定寄主对假尾孢菌毒素的抗性是可行的，由于用毒素处理雷公藤的方法对环境没有影响，所以这将为今后雷公藤产品的开发与利用提供理论参考。

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