马应龙麝香痔疮膏对直肠黏膜急性损伤的修复作用及机制研究Δ

姜义武，李 杰，唐海云，钱珊英，赵 冲

(1.东莞常安医院药剂科，广东 东莞 523560；2.东莞常安医院护理部，广东 东莞 523560；3.东莞常安医院检验科，广东 东莞 523560；4.东莞常安医院普外科，广东 东莞523560)

马应龙麝香痔疮膏对直肠黏膜急性损伤的修复作用及机制研究Δ

姜义武1*，李 杰2，唐海云1，钱珊英3，赵 冲4

(1.东莞常安医院药剂科，广东 东莞 523560；2.东莞常安医院护理部，广东 东莞 523560；3.东莞常安医院检验科，广东 东莞 523560；4.东莞常安医院普外科，广东 东莞523560)

目的：探讨马应龙麝香痔疮膏对直肠黏膜急性损伤的修复作用及机制。方法：选取成年雄性SD大鼠240只作为研究对象，按照编号顺序分为对照组与观察组，每组120只。2组大鼠给予全身麻醉，将3%的乙酸棉签经大鼠肛门置入直肠30 s。观察组大鼠在损伤后30 min开始给予马应龙麝香痔疮膏20 mg，1日2次，连用7 d。对照组大鼠无任何药物干预。2组于第7日使用药物后的30 min及24、72、120 h各处死30只大鼠，在15倍放大镜下，观察2组大鼠直肠的形态特征，并采用苏木精-伊红进行染色，观察马应龙麝香痔疮膏对各指标的影响。结果：治疗后24、72、120 h，观察组大鼠直肠黏膜损伤计分显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。直肠黏膜损伤24 h后，观察组大鼠血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9水平均显著低于对照组；直肠损伤72、120 h，血管内皮生长因子、诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素8、基质金属蛋白酶9、缺氧诱导因子-1α和增殖细胞核抗原的阳性表达率均显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：马应龙麝香痔疮膏能够显著缓解直肠黏膜急性损伤程度，加快损伤愈合速度。

直肠黏膜急性损伤；马应龙麝香痔疮膏；修复；作用机制

结直肠黏膜急性损伤多见于急性直肠炎、急性溃疡性结肠炎、痔急性发作等疾病。相关临床研究表明，马应龙麝香痔疮膏治疗直肠黏膜急性损伤，疗效较好，但缺少病理学基础研究。本研究通过建立苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色、免疫组化SP法染色和弹性纤维染色方法，观察马应龙麝香痔疮膏促进上皮细胞和腺体增生、减少肉芽组织的形成情况，探索马应龙麝香痔疮膏修复痔组织病理形态的作用机制。

1 材料

1.1 药品与试剂

马应龙麝香痔疮膏(马应龙药业集团股份有限公司，批号：20160127)；苏木精-伊红染色剂(南昌雨露实验器材有限公司)，乙酸为分析纯。

1.2 动物

选取成年雄性SD大鼠240只作为研究对象，体质量约240 g，按照编号顺序分为对照组与观察组，每组120只。

2 方法

2.2 实验方案

2.2.1 大鼠直肠黏膜损伤模型的建立：采用全身麻醉途径，应用经浓度为3%的乙酸蘸过的棉签置于大鼠肛门直肠处，时间为0.5 min。然后将240只SD大鼠直肠黏膜损伤模型按照奇偶数分组方法均分为对照组与观察组。观察组大鼠在损伤后30 min～7 d给予马应龙麝香痔疮膏20 mg，1日2次；对照组大鼠未采用任何药物进行干预治疗。2组于第7日使用药物后的30 min及24、72、120 h各处死30只大鼠，2组大鼠于相同时间处死，在15倍放大镜下，观察2组处死大鼠直肠的形态特征。根据文献中黏膜损伤的计分方法[1]，对黏膜损伤进行计分。

2.2.2 染色方法：使用苏木精-伊红染色大鼠肾脏组织。根据相关文献[2]，采用7种分别针对CD34、血管内皮生长因子(VEGF)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素8(IL-8)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和增殖细胞核抗原(PCNA)的单克隆抗体行免疫组化SP染色。

2.3 判断标准

IL-8的阳性判定标准：血管内皮细胞或者细胞核出现棕黄色颗粒；VEGF、MMP9、iNOS和PCNA的阳性判定标准：胞浆内或者细胞核出现棕黄色颗粒；HIF-α的阳性判定标准：细胞质出现棕黄色颗粒。参考相关文献中的评分标准[3]，将染色结果从染色强度和染色细胞数量2个方面进行分析。

2.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，数据的对比采用配对t检验；对待测指标表达强度的高低采用t检验和Kruskal-WallisH检验进行统计分析。

3 结果

3.1 2组大鼠黏膜损伤计分比较

直肠黏膜损伤后24、72、120 h，观察组大鼠黏膜损伤计分均显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

组别黏膜损伤计分30min24h72h120h对照组(n=10)8.08±0.548.05±0.526.62±0.334.09±0.24观察组(n=10)8.15±0.607.01±0.394.12±0.272.97±0.18t0.1873.3894.4934.012P0.3280.0410.0330.035

3.2 2组大鼠染色结果比较

直肠黏膜损伤24 h后，观察组大鼠MMP9及VEGF水平显著低于对照组；直肠黏膜损伤后72、120 h，观察组大鼠VEGF、iNOS、IL-8、MMP9、HIF-1α、PCNA的阳性表达率分别为10.00%、10.00%、7.50%、6.67%、13.33%、15.00%，均显著低于对照组的20.00%、28.33%、20.00%、33.33%、26.68%、20.00%，差异均有统计学意义(P<0.05)。2组大鼠不同时间节点染色指标表达比较的统计学分析见表2。2组大鼠标本损伤72 h后的免疫组化染色图见图1。

表2 2组大鼠标本不同时间节点各项免疫组化染色指标表达比较的统计学分析Tab 2 Statistical analysis on comparison of immunohisto-chemical staining indicators at different time points between two groups

注：“*”为Kruskal-WallisH检验，“#”为t检验

Note：“*” means Kruskal-Wallis H test, “#” means t test

A. 对照组大鼠IL-8呈强阳性表达；B.观察组大鼠IL-8呈阴性表达；C.对照组大鼠PCNA呈强阳性表达；D.观察组大鼠PCNA呈弱阳性表达；E.对照组大鼠iNOS呈强阳性表达；F.观察组大鼠iNOS呈阴性表达；G.对照组大鼠HIF-1α呈强阳性表达；H.观察组大鼠HIF-α呈阴性表达。A. the IL-8 of control group is positive expression; B. the IL-8 of observation group is negative expression; C. the PCNA of control group is weakly positive expression; D. the PCNA of observation group is positive expression; E. the iNOS of control group is strongly positive expression; F. the iNOS of observation group is negative expression; G. the HIF-1αof control group is strongly positive expression; H. the HIF-1αof observation group is negative expression图1 2组大鼠标本损伤72 h后的免疫组化染色图(SP法，×400)Fig 1 Immunohistochemistry staining results of rats after injury of 72 h(SP method，×400)

4 讨论

近年来，人们饮食结构和生活习惯的改变导致了我国痔疮的高发。目前，我国治疗痔疮的外用产品主要有马应龙麝香痔疮膏(栓剂)、云南白药痔疮膏(栓剂)、复方角菜酸酯乳膏(栓剂)。随着马应龙麝香痔疮膏的广泛应用，其在口腔溃疡、创口愈合、子宫颈糜烂等方面都显示出较好的治疗效果[4]。临床相关研究发现，马应龙麝香痔疮膏有促进创面愈合、减轻瘙痒和解毒等作用[5-7]。

马应龙麝香痔疮膏由人工麝香、人工牛黄、琥珀、冰片、珍珠、硼砂等组成，具有清热消毒、活血化瘀、去腐生肌等作用。麝香辛温行散，活血消肿，通经散结止痛，芳香走窜，有消除一切恶疮、痔、瘘肿痛及去腐生肌之功效；牛黄为清热解毒之良药，善治痈、疽、疔、疮；珍珠含有碳酸钙及各种氨基酸，具有清热解毒、生肌敛疮、止血消炎之功效；冰片具有较强的止痛、消炎、祛腐、生肌、抗感染、改善局部血液循环和加速创面愈合的作用。从黏膜损伤的角度探讨马应龙麝香痔疮膏对黏膜层柱状上皮、杯状细胞、肌纤维、结缔组织的修复情况对临床应用该药有意义，或许能为溃疡修复和创面愈合等研究提供一种潜在的全新思路。

近年来，各种实验技术不断进步，给直肠黏膜损伤的基础研究与临床治疗带来了长足的发展，一些中成药已经在肠黏膜损伤中显示了强大的修复功能。组织修复过程中的细胞增生是受生长因子调控的，生长因子加速创伤修复的机理主要涉及生长因子参与炎症反应，影响细胞周期转变，促进RNA、DNA的合成、诱导新血管形成及细胞外基质沉淀等[8-9]。

王振军等[3]探讨了表面黏膜的损伤是痔疮发生、发展的病理形态改变之一，同时探讨了复方角菜酸酯栓对大鼠直肠急性黏膜损伤治疗前后黏膜的病理变化，并通过免疫组织化学方法研究复方角菜酸酯栓对与炎症/损伤的基因(MMMP9、VEGF、iNOS、IL-8、PCNA、HIF-1α、MVD)表达的影响。王红英等[10]采用热板镇痛法、小鼠皮内色素渗出法进行研究，结果表明，马应龙麝香痔疮膏具有抗炎镇痛的作用。刘惟莞等[11]采用小鼠耳肿胀法、小鼠断尾出血时间测定法等实验研究，阐述了溃疡表面坏死及渗出物状况、肉芽组织中新生血管状况、纤维母细胞的数量及大小、炎性水肿、炎性细胞浸润程度等，认为马应龙麝香痔疮膏具有活血化瘀、去腐生肌的作用；同时观察到马应龙麝香痔疮膏具有促进纤维母细胞生成少量胶原纤维的作用[12-14]。

本研究拟在大鼠直肠黏膜损伤模型中，运用光镜、超微电镜和染色等方法，观察黏膜损伤及治疗前后痔疮组织的病理形态学改变，探讨马应龙麝香痔疮膏对黏膜损伤治疗的作用机制。结果显示，治疗后24、72、120 h，观察组大鼠直肠黏膜损伤计分显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。直肠黏膜损伤24 h之后，观察组大鼠VEGF、MMP9水平均显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，马应龙麝香痔疮膏能够显著缓解直肠黏膜急性损伤程度，加快损伤愈合速度；该药的重要机制可能为通过降低MMP9、VEGF、IL-8、PCNA、iNOS及HIF-1基因的表达来保护直肠黏膜急性损伤。

[1]Bjelkengren G，Aronsen KF，Augustsson NE，et al.Radioprotective effect of local administration of lysine-vasopressin and triglycyl-lysine-vasopressin on the rectal mucosa in rats[J].Acta Oncol，1995，34(4)：487-492.

[2]Weidner N，Semple JP，Welch WR，et al.Tumor angiogenesis and metastasis—correlation in invasive breast carcinoma[J].N Engl J Med，1991，324(1):1-8.

[3]王振军，汤秀英，王东，等.内痔的病理形态特征及其意义[J].中华外科杂志，2006，44(3)：177-180.

[4]滕帆.中成药马应龙麝香痔疮膏的合理应用[J].黑龙江医药，2014，27(2)：373-375.

[5]杨增芳，葛玲霞，许伍.马应龙麝香痔疮膏治疗小儿尿布皮炎120例[J].陕西中医，2005，26(3)：224-225.

[6]周晓军.马应龙麝香痔疮膏为主治疗带状疱疹[J].上海中医药杂志，1996，30(12)：25.

[7]赵宇冰，李瑜.马应龙麝香痔疮膏治疗糖尿病性皮肤溃疡37例观察[J].甘肃中医，2007，20(3)：45.

[8]Kerstein MD.The Physiology of wound healing[M].Pennsylvnaia:Allehgeny University of the thealth Scieness，1998：21-23.

[9]Harrison CA，Gray PC，Vale WW，et al.Antagonists of activin signaling: mechanisms and potential biological applications[J].Trends Endocrinol Metab，2005，16(2)：73-80.

[10]王红英，石明健，刘惟莞，等.马应龙麝香痔疮栓抗炎镇痛作用的实验研究[J].湖北医科大学学报，1988，19(1)：31-32.

[11]刘惟莞，舒清波，石明健，等.马应龙八宝软膏活血化瘀、祛腐生肌作用实验研究[J].中成药，1996，18(5)：37-38.

[12]姜爱琴，高庆元，刘长宝．芦荟生肌膏对大鼠直肠损伤模型的治疗机制[J].中国中西医结合外科杂志，2010，16(4)：442-444.

[13]楼彩霞，胡立春，黎小平，等.乙酸诱导建立大鼠急性直肠黏膜损伤模型的形态学观察[J].中国实验动物学报，2015，23(2)：143-146，152.

[14]张罗生，何本夫，罗显荣，等.小牛血清去蛋白提取物防治急性放射性直肠炎的临床研究[J].实用医学杂志，2012，28(9)：1519-1521.

Study on the Repairing Effects and Mechanism of Musk Hemorrhoids Ointment on Acute Injury of RectalΔ

JIANG Yiwu1, LI Jie2, TANG Haiyun1, QIAN Shanying3, ZHAO Chong4

(1.Dept.of Pharmacy, Dongguan Chang’an Hospital, Guangdong Dongguan 523560, China; 2.Dept.of Nursing, Chang An Hospital, Dongguan Chang’an Hospital, Guangdong Dongguan 523560, China; 3.Dept.of Laboratory, Chang An Hospital, Dongguan Chang’an Hospital, Guangdong Dongguan 523560, China; 4.Dept.of General Surgery, Chang An Hospital, Dongguan Chang’an Hospital, Guangdong Dongguan 523560, China)

OBJECTIVE：To probe into the repairing effects and mechanism of musk hemorrhoids ointment on acute injury of rectal. METHODS: 240 male SD rats were extracted to be divided into observation group and control group via the serial number, with 120 cases in each. Two groups were general anesthetized with 3% acetic acid cotton swabs for 30 s. The observation group were given 20 mg musk hemorrhoids ointment after injury of 30 min, twice a day for 7 d; while the control group were not treated with any drugs. On the 7th day, after administration of 30 min, 24 h, 72 h and 120 h, 30 rats in each group were killed. Under 15-time magnifier, the morphological characteristics of rectum of two groups were observed. The hematoxylin-eosin stain was used to analyze the effects of musk hemorrhoids ointment on these indexes. RESULTS: After treatment of 24 h, 72 h and 120 h, the rectal mucosa damage score of observation group was lower than that of control group, with statistically significant difference(P<0.05). After rectal mucosa damage of 24 h, the VEGF, MMP9 level of observation group were lower than those of control group; after rectal mucosa damage of 72 h and 120 h, the positive expression rate of VEGF、iNOS、IL-8、MMP9、HIF-1α、PCNA was significantly lower than that of control group, with statistically significant difference(P<0.05). CONCLUSIONS: Musk hemorrhoids ointment can significantly relieve the acute rectal mucosal injury and accelerate the speed of wound healing.

Acute rectal mucosal injury; Musk hemorrhoids ointment; Repairing; Mechanism

东莞市科技局项目(No.201610515000147)

R96

A

1672-2124(2017)02-0176-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.02.010

2016-10-07)

*副主任药师。研究方向：药理分析。E-mail：juanhhmm@163.com