HPLC法测定火腿肠中山梨酸、苯甲酸提取条件优化

李英，栾丽英

（1.烟台南山学院，山东烟台265713；2.鲁东大学，山东烟台264025）

HPLC法测定火腿肠中山梨酸、苯甲酸提取条件优化

李英1，栾丽英2

（1.烟台南山学院，山东烟台265713；2.鲁东大学，山东烟台264025）

研究了HPLC方法测定火腿肠中山梨酸、苯甲酸含量时影响山梨酸、苯甲酸提取的3个主要因素：超声时间、沉淀剂用量和料液比。并通过单因素和正交试验得到火腿肠中山梨酸、苯甲酸提取的最优工艺条件。当超声时间为15min、亚铁氰化钾和乙酸锌各添加3mL、料液比为1∶11（g/mL）时提取效果最好。数据表明该方法线性关系相关系数良好（0.999 9～1.000 0），平均加标回收率均在90%以上，简化了预处理过程，具有检测速度快、灵敏度和准确度高、自动化程度高等优点。

高效液相色谱法；火腿肠；山梨酸；苯甲酸；提取

在火腿肠的生产加工中使用较广泛的防腐剂以苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐为主[1]。防腐剂可以抑制和杀灭微生物，但过量和超标加入会破坏食品中维生素、在一定程度上会抑制骨骼生长，危害肾、肝脏的健康，并引起毒性反应[2]。我国食品添加剂使用卫生标准中对火腿肠类肉制品中苯甲酸、山梨酸及其钾盐的使用范围和最大使用量都有规定[3-4]。但由于不法生产厂家违规使用防腐剂，在流入市场的火腿肠制品的检测中仍可检出苯甲酸和超标加入的山梨酸。

高效液相色谱技术（HPLC）广泛应用于各种食品添加剂的检测[5-11]，是目前检验防腐剂最常用且有效的方法，HPLC可以同时检测多种防腐剂，在简便快捷、真实有效的基础上还提高了检测效率。在国标GB/T 5009.29-2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》中苯甲酸、山梨酸测定的液相色谱法中，没有提及火腿肠类肉制品的样品处理方法[4]。火腿肠制品中含高蛋白、高脂肪及淀粉等基质成份较多，并且苯甲酸、山梨酸的脂溶性造成了样品处理的复杂，在HPLC检测火腿肠中山梨酸钾、苯甲酸钠的过程中，用普通的提取方法不是很理想，提取不够完全[12-15]，干扰因素很多。本文通过试验研究影响提取火腿肠中的山梨酸、苯甲酸的3个因素：超声时间、沉淀剂选择、料液比，对样品处理方法进行了改进和研究，优化了检测过程，使得最终的检测方法简单快速、灵敏准确、检测限低、经济可行。

1 材料

1.1 仪器与设备

Agilent1100高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；AL104电子天平（精确至0.000 1 g）：梅特勒-托利多（中国）有限公司；HR7628/00食品加工机：飞利浦电子（上海）有限公司；VORTEX-6漩涡混合器：其林贝尔仪器制造有限公司；JT-1027HT超声波清洗机：深圳市洁拓超声波清洗机设备有限公司；TOMYMX-307套筒式微量冷冻离心机：天美（中国）科学仪器有限公司；WP-UP-1510实验室专用超纯水机：四川中浪科技有限公司。

其他：微量移液器（100、200、1 000μL）；刻度移液管（5、10mL）；离心管（100mL）；比色管（50mL）；有机相滤膜（0.45μm）；2mL注射器；2mL样品瓶（Agilent）等。

1.2 试剂和材料

1）材料：火腿肠（市售）。

2）试剂：三氯乙酸（色谱纯），甲醇（色谱纯），磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，亚铁氰化钾、乙酸锌均为优级纯；山梨酸、苯甲酸混合标准品（美国sigma公司）；超纯水。

2 方法

2.1 样品制备

首先用食品加工机将火腿肠样品绞碎，混匀，装入样品袋备用。每个样品搅拌完后应认真清洁食品加工机，并擦干，防止样品互相污染。

2.2 试样提取时间的优化

称取5 g经充分绞碎过的均匀试样至50mL的比色管中，在称取的过程中要避免交叉污染，加入30mL左右的甲醇-磷酸盐缓冲液，1mL1%的三氯乙酸，在振荡器上振荡3min，放入超声机中超声处理。在单因素优化试验中，超声的时间分别选择5、10、15、20min和25min。

2.3 试样净化沉淀剂种类的选择及用量的优化

向超声后的样品提取液中分别加入亚铁氰化钾和乙酸锌、钨酸钠或硫酸铜作为沉淀剂，定容后振荡3 min，继而转入100mL离心管中，4 000 r/min离心5 min。在选取亚铁氰化钾和乙酸锌作为最佳沉淀剂后，按照两者各为1、2、3、4mL和5mL的添加量，以沉淀湿重为评价指标进行沉淀剂使用量的优化。离心前对离心管进行称重，离心后对离心管和沉淀的总重进行再次称重，两者的差值即为沉淀的湿重。

2.4 试样提取料液比的优化

按照火腿肠与甲醇-磷酸盐溶剂1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13（g/mL）的比例进行料液比的优化，其中超声波提取时间为15min，沉淀剂为亚铁氰化钾和乙酸锌。

2.5 山梨酸和苯甲酸含量的测定

2.5.1 液相色谱条件

仪器配置：超高效液相色谱仪（Agilent1100）；色谱柱：Phenomenex C18液相色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：A为5%甲醇-0.02mol/L乙酸铵水溶液，C为甲醇；流速：1.000mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃；检测器：紫外检测器；波长：230 nm。流动相梯度洗脱参数见表1。

表1 流动相梯度洗脱Table1 Gradient elution of mobile phase

2.5.2 标准曲线的制作

标准工作液：准确移取山梨酸、苯甲酸国标液（1 mg/kg）5mL，至50mL容量瓶中，加水稀释至刻度。将配制好的标准工作液密封后避光4℃保存，有效期为3个月。

标准系列溶液：准确移取标准工作液适量，至10mL比色管中，加水稀释至刻度，配制成山梨酸、苯甲酸混标，浓度为：0.2、0.5、1.0、5.0、10.0mg/L。

2.5.3 样品中山梨酸和苯甲酸含量的测定

样品提取液过0.45 um滤膜后备用。测试条件同2.5.1。

3 结果分析

3.1 标准曲线

分别取1mL 0.2、0.5、1.0、5.0、10.0mg/L的标准溶液进仪器，以山梨酸、苯甲酸混合标准品浓度（mg/L）为横坐标、峰面积为纵坐标，得出山梨酸、苯甲酸的标准曲线，得到线性方程、相关系数，根据3倍信噪比计算检出限，结果见表2。

3.2 波长的选择

苯甲酸检测的最佳波长在230 nm，而山梨酸检测的最佳波长在254 nm，为了同时测定两种组分，选择检测波长为230 nm，以获得最大灵敏度。

表2 线性方程、相关系数、线性范围及检出限Table2 Linear equation，correlation coefficient，linear range and detection limit

3.3 超声提取时间选择

在山梨酸、苯甲酸平均回收率大于90%时，当超声时间为5、10、15、20、25min在其他处理方法相同的条件下，同一个加标的火腿肠样品中山梨酸、苯甲酸提取效果见图1。

图1 超声时间对提取效果的影响Fig.1 The effect of ultrasonic time on results

由图1可看出，在室温条件下，超声时间在5min～15 min之间时，随着时间延长，提取效果明显增强，超声提取时间为15 min时，提取效果最明显，超过15min，增加效果不明显。选定提取时间10、15、20min做正交试验。

3.4 沉淀剂的选择

火腿肠类制品蛋白质含量较高，因而在样品的处理过程中，应该选取沉淀效果较好的沉淀剂以达到去除样品中蛋白质的目的。目前使用的最主要的蛋白质沉淀剂有3种：亚铁氰化钾和乙酸锌、钨酸钠、硫酸铜。选取同一阴性火腿肠样品，添加相同量的山梨酸、苯甲酸混合标准溶液，分别采用3种沉淀剂进行试验，试验结果如图2。

由图2可知，使用亚铁氰化钾和乙酸锌作为沉淀剂能较好的沉淀蛋白质，进而防止了色谱柱的堵塞，延长了设备的使用寿命。

3.5 沉淀剂的用量

图2 不同沉淀剂对提取效果的影响Fig.2 The effect of different precipitation agent on results

当使用亚铁氰化钾和乙酸锌各1mL时，有少量沉淀析出，称量后发现沉淀的湿重为2.05 g；当使用亚铁氰化钾和乙酸锌各2mL时，有大量沉淀析出，称量后发现沉淀的湿重为4.96 g；当使用亚铁氰化钾和乙酸锌各3、4mL和5mL时，沉淀的析出量与使用2mL时大体相同，分别为5.13、5.20 g和5.18 g。以节约试剂为原则，选用两种沉淀剂各2mL。

3.6 提取溶剂量的选择

山梨酸、苯甲酸都是微溶于水的物质，但易溶于乙醚、甲醇、乙醇等有机溶剂。火腿肠是一种蛋白质含量多的复杂基质，比较适合用甲醇-磷酸盐作为提取剂。本文选取甲醇-磷酸盐作为提取溶剂来提取山梨酸和苯甲酸，按照样品与提取溶剂1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13（g/mL）的比例进行提取效率的研究。选取同一阴性火腿肠样品添加相同量的山梨酸、苯甲酸混合标准溶液，试验结果如图3。

图3 不同料液比对提取效果的影响Fig.3 The effect of different ratio of material to liquid on results

由图3可知，样品质量与提取溶剂甲醇-磷酸盐缓冲液体积比为1∶9、1∶11、1∶13（g/mL）3种比例提取效果均较好，在试验结果良好的基础上，以最佳的提取效果和最少的溶剂量为原则，选取样品质量与提取溶剂的体积比1∶9为最适的用量。选定料液比1∶7、1∶9、1∶11（g/mL）3种比例做正交试验。

3.7 脂肪对分析方法的干扰与消除

火腿肠样品脂肪含量较高，这对试验结果产生一定的影响，比如可能会导致色谱的峰形不规则，影响试验结果的分析；也可能会使进样阀堵塞或磨损，甚至堵塞色谱柱，最终导致仪器的使用寿命降低。由于提取液所含脂肪在震荡时可以产生球状悬浮物，漂浮在提取液的上层，并且在加入蛋白质沉淀剂后，减少了脂肪的乳化，脂肪与提取液充分离析。将样品提取液于95℃的恒温水浴锅中加热15min，使脂肪充分融化[12]。取出并冷却至室温后，于-1℃条件下冷藏，大部分的脂肪会在冰点处析出，经处理后的样品提取液中基本不含脂肪，以消除脂肪对测定结果的干扰。

3.8 采用不同提取方法测定火腿肠中山梨酸和苯甲酸含量的正交试验结果

选取超声时间、料液比、沉淀剂3个关键因素设计正交试验，以确定最佳提取条件，提取次数为1次。正交因素水平见表3[16-17]。

表3 正交试验因素水平表Table3 Orthogonal experimental factor level table

正交试验结果见表4。

表4 正交试验结果Table4 Orthogonal experimental results

续表4 正交试验结果Continue table4 Orthogonal experimental results

表4的正交试验结果表明，以上3种因素的影响顺序为A﹥B﹥C，即极差R最大的是超声时间，第2水平为优，以超声时间15min为最佳；其次是沉淀剂，第3水平为优，以亚铁氰化钾和乙酸锌各加3mL为最好；极差最小的是料液比，第3水平为优，即样品质量与提取溶剂的体积比1∶11（g/mL）时，对山梨酸、苯甲酸的提取效果最好。综上所述，三因素的最优水平组合为A2B3C3，即超声提取时间为15min，沉淀剂亚铁氰化钾和乙酸锌各添加3mL，料液比1∶11（g/mL）试验效果最佳。以该最优组合进行3次平行验证试验，得出平均回收得率为98.51%，说明该优化工艺参数可用于指导火腿肠制品中山梨酸、苯甲酸的提取。

3.9 加标回收率和方法精密度试验

本方法测量精密度主要是通过加标回收率来表示。待测样品选用未检出山梨酸、苯甲酸的火腿肠（即阴性样品）作为加标回收率实验样品，向破碎均匀的火腿肠中添加0.25、0.5、1mg/kg 3个不同浓度的山梨酸、苯甲酸混合标准溶液，依照上述最优前处理方法[即料液比1∶11（g/mL）、亚铁氰化钾和乙酸锌各添加3mL、超声15min]进行检测，对每个不同浓度分别进行6次平行试验，然后取平均值，测得回收率如表5。

表5 山梨酸、苯甲酸的加标回收率和精密度结果Table5 Recovery and precision results of sorbitol acid and benzoic acid

续表5山梨酸、苯甲酸的加标回收率和精密度结果Continue table5 Recovery and precision results of sorbitol acid and benzoic acid

由表5可以看出，用本方法进行加标回收试验时，回收率在91.95%到95.28%之间，相对标准偏差变异系数在1.6%到4.2%之间，说明此检测方法的准确度和精密度都很高。

4 结论

试验结果表明，当超声时间为15min、亚铁氰化钾和乙酸锌添加量为3mL、料液比为1∶11（g/mL）时提取效果较好，并且本方法对火腿肠中的山梨酸、苯甲酸测定效果良好，回收率高。该方法线性关系相关系数良好（0.999 9～1.000 0），平均加标回收率均在90%以上。

本检测方法实现了火腿肠类制品中山梨酸和苯甲酸的优良的提取分离，适用于各种火腿肠中山梨酸、苯甲酸的定性、定量测定。具有前处理方法简单、多个样品同时测定、针对性强、分析周期短、检出限低等优点，检测方法实用，结果可靠，适于样品大批量的样品检测，具有较高的实用价值。

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Optimization of Extraction Condition on the Determination of Sorbic Acid and Benzoic Acid in Ham Sausage by High Performance Liquid Chromatography

LI Ying1，LUAN Li-ying2
（1.Yantai Nanshan University，Yantai265713，Shandong，China；2.Ludong University，Yantai264025，Shandong，China）

The effects of three main factors on the extraction of sorbic acid and benzoic acid in HPLC：ultrasonic time，precipitation agent，and material liquid ratio were studied. By single factor extraction tests and the orthogonal tests the optimum extracting conditions for sorbic acid and benzoic acid in ham sausage were confirmed as follows：the ultrasonic time 15 min，added potassium ferrocyanide and zinc acetate each for 3 mL as precipitant，liquid material ratio 1 ∶ 11 （g/mL）. The results showed that the method had good linear correlation coefficient（0.999 9-1.000 0），and the average recovery rate of the method was more than 90 %，which had the advantages of simple，fast detection，high sensitivity，high accuracy，and high automation degree.

high performance liquid chromatography；ham sausage；sorbic acid；benzoic acid；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.028

2016-05-14

2015年度山东省青年教师教育教学研究课题（一般项目）（15SDJ160）

李英（1983—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品科学。