木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白的抗氧化性研究

邹险峰，陈丽娜，吴琼，怀影，张莉弘

（长春大学食品科学与工程学院，吉林长春130022）

木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白的抗氧化性研究

邹险峰，陈丽娜，吴琼，怀影，张莉弘

（长春大学食品科学与工程学院，吉林长春130022）

采用木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白制备抗氧化肽。以自由基的清除率为评价指标，通过单因素试验和正交试验确定酶解最佳条件。结果显示：最佳条件为pH7.5，酶和底物比8 000U/g，水解时间3 h，温度60℃。优组合条件下的羟自由基清除率为77.6%，超氧阴离子的清除率为47.3%。

大豆球蛋白；抗氧化性；木瓜蛋白酶

自由基是化合物分子在光热等外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或分子。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是最主要的一类自由基，存在未配对电子的含氧分子，主要包括超氧阴离子和羟自由基等，具有很强的化学活性。ROS既可由机体正常代谢产生并参与机体的正常生理功能，也能够因受到外界刺激（如吸烟、辐射和精神压力等）而在机体内大量产生而损伤生物有机体。研究显示，多种疾病的发生、发展，如白内障、老年痴呆症、心血管疾病等都同ROS损伤相关[1-3]。机体内部存在自由基的清除系统，包括抗氧化酶系统如：超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等，还有各种具有抗氧化功能的小分子如：谷胱甘肽、维生素等。现代人的生活环境和工作压力会导致机体产生大量的活性氧自由基，机体需要从外界摄入更多的高效抗氧化物质来消除活性氧自由基对机体的损伤。

各种蛋白水解肽已经表现出明显的抗氧化性。Yu J等通过酶解螺旋藻并纯化获得一条Pro-Asn-Asn水解肽，清除DPPH自由基能力与GSH近乎等同，且同时具有清除超氧阴离子和羟自由基的能力[4]；Jin DX等酶解玉米蛋白粉获得水解肽表现出优秀的DPPH自由基和超氧阴离子清除能力[5]；YousrM等的研究表明蛋黄蛋白质水解肽具有清除超氧阴离子和羟自由基的能力[6]。大豆是一种重要的农产品，其蛋白质含量高达干重的40%，目前大豆蛋白质主要作为食品添加剂被广泛应用于食品加工，对大豆蛋白水解肽的功能性研究更有价值。

利用木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白，通过单因素和正交试验确定抗氧化能力更高的大豆肽水解条件，为大豆抗氧化肽的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

大豆球蛋白：长春大学农产品深加工实验室自制[7]；木瓜蛋白酶（1 000 U/mg）：北京鼎国昌盛生物技术有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FDU-2100型冷冻干燥仪：日本EYELA公司；J-26XP型高速冷冻离心机：美国BECKMAN COULTER公司；UV-2550型分光光度仪：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 指标测定

蛋白酶活力测定采用福林法[8]；超氧阴离子的清除率测定采用邻苯三酚法[9]；羟自由基的清除率测定采用邻二氮菲法[10]。

1.3.2 酶解工艺路线和酶解条件优化

1.3.2.1 木瓜蛋白酶酶解的工艺路线

大豆球蛋白→调浆→酶解→灭酶→酸沉→离心→上清液冷冻干燥

1.3.2.2 单因素试验

以超氧阴离子和羟自由基的清除率为指标研究不同的酶与底物比、水解时间、pH值和温度对木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白的影响。

1.3.2.3 正交试验

在单因素试验基础上，选择酶与底物比、酶解时间、酶解温度和pH值作为考察因素，采用正交表L9（34）进行正交试验，筛选大豆球蛋白的最佳酶解条件，并对最佳条件进行验证试验。

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白的单因素试验

2.1.1 酶与底物比的影响

水解条件：温度55℃，pH7.5，水解时间3 h。以超氧阴离子和羟自由基的清除率为指标研究4 000、6 000、8 000、10 000、12 000U/g的酶与底物比对水解的影响。酶与底物比对自由基清除率的影响见图1。

图1 酶与底物比对自由基清除率的影响Fig.1 Effects of enzyme concentration on scavenging rate of radical

由图1可以看出，羟自由基的清除率随酶与底物比呈现先升高后降低的趋势，在8 000 U/g时羟自由基清除率最高；在较低的酶与底物比时，超氧阴离子的清除率随之逐渐升高，≥8 000U/g时超氧阴离子的清除率变化不规则。

2.1.2 pH值的影响

水解条件：酶和底物比8 000U/g，温度55℃，水解时间3 h。以超氧阴离子和羟自由基清除率为指标研究6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的pH值对水解的影响。pH值对自由基清除率的影响见图2。

图2 pH值对自由基清除率的影响Fig.2 Effects of pH on scavenging rate of radical

由图2可以看出，pH 6.0和6.5的羟自由基清除率较低，pH 7.0～8.0羟自由基清除率显著升高，pH 7.5时的羟自由基清除率最大；超氧阴离子的清除率整体呈现不规则变化。

2.1.3 水解时间的影响

水解条件：酶和底物比8 000 U/g，温度55℃，pH 7.5。以超氧阴离子和羟自由基清除率为指标研究1、2、3、4、5 h的水解时间对水解的影响。水解时间对自由基清除率的影响见图3。

图3 水解时间对自由基清除率的影响Fig.3 Effects of time on scavenging rate of radical

由图3可以看出，羟自由基的清除率随水解时间呈现先升高后降低的趋势，水解3 h羟自由基清除率最大；超氧阴离子的清除率同样呈现不规则变化。

2.1.4 水解温度对水解的影响

水解条件：酶和底物比8 000 U/g，pH 7.5，水解时间3 h。以超氧阴离子和羟自由基清除率为指标研究40、45、50、55、60℃的水解温度对水解的影响。水解温度对水解度的影响见图4。

图4 水解温度对水解度的影响Fig.4 Effects of temperature on scavenging rate of radical

由图4可以看出，羟自由基的清除率与温度变化正相关，55℃基本达到最大的羟自由基清除率；超氧阴离子的清除率变化既不明显也不规则。

2.2 正交试验

由以上单因素试验可知，在不同的酶与底物比、pH值、水解时间和温度下，羟自由基清除率变化有明显的规律性，而超氧阴离子清除率变化没有规律性。此外，超氧阴离子在机体内主要通过超氧化物歧化酶催化清除，得到产物过氧化氢，而过氧化氢对机体的损伤性更强，需要谷胱甘肽还原酶或者过氧化氢酶协同作用才能消除超氧阴离子对机体的损伤[11]；羟自由基是最活跃的活性氧自由基，羟自由基的清除对机体更为重要。因此选择羟自由基清除率作为正交试验研究的指标。根据单因素试验的结果，对pH值、酶和底物比、水解时间和温度四种因素各取三个水平，进行L9（34）正交试验，正交试验的因素、水平设计见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平Table1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交试验结果Table2 Results of orthogonal experiment

由极差分析可知，各因素对水解度的影响大小顺序为C＞B＞D＞A，即水解时间＞酶和底物比＞温度＞pH值。根据K值大小得到酶解反应条件的优组合为A2B2C2D3，即pH7.5，酶和底物比8 000 U/g，水解时间3 h，温度60℃，该条件不在正交试验9组条件中，需进一步进行验证试验。验证试验结果显示：优组合条件下的羟自由基清除率为77.6%，超氧阴离子的清除率为47.3%。该条件下的羟自由基清除率要高于正交试验结果的最大值75.2%，表现出更好的羟自由基清除能力。

3 结论

采用木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白，结果表明，最佳的酶解条件为pH7.5，酶和底物比8 000 U/g，水解时间3 h，温度60℃。优组合条件下的羟自由基清除率为77.6%，超氧阴离子的清除率为47.3%。本研究为大豆水解肽的抗氧化性功能的开发提供了理论参考。

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Study on Antioxidation of Papain Enzymolysis on Glycinin

ZOU Xian-feng，CHEN Li-na，WU Qiong，HUAI Ying，ZHANG Li-hong
（College of Food Science and Engineering，Changchun University，Changchun 130022，Jilin，China）

Glycinin was hydrolyzed by papain to produce antioxidant peptide.Base on the scavenging rate of radical，optimum enzymatic hydrolysis conditions were determined by single-factor and orthogonal test.Results showed that these optimum conditions were followed：pH 7.5，8 000 U/g of enzyme concentration，3 h of reaction time and 60℃.In these conditions，the scavenging rate of hydroxyl radical and superoxide anion were 77.6%and 47.3%respectively.

glycinin；antioxidation；papain

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.004

2016-05-27

吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目（2016296）

邹险峰（1971—），男（汉），讲师，博士研究生，研究方向：食品生物技术。