电针对坐骨神经损伤大鼠神经生长导向因子Netrin-1受体DCC的影响※

杜 旭 王瑞辉 王鹏利 王 宇 张兆星 陈超朝 刘雯雯

（陕西中医药大学针灸推拿学院，咸阳712046）

电针对坐骨神经损伤大鼠神经生长导向因子Netrin-1受体DCC的影响※

杜 旭 王瑞辉 王鹏利 王 宇 张兆星 陈超朝 刘雯雯

（陕西中医药大学针灸推拿学院，咸阳712046）

目的探讨电针对大鼠坐骨神经损伤后神经导向因子Netrin-1受体DCC的影响。方法SD大鼠70只，随机分为空白对照组（10只）、假手术组（20只）、模型对照组（20只）和电针治疗组（20只）。后两组大鼠右坐骨神经横断后即刻端对端缝合。电针治疗组取“环跳”、“足三里”进行治疗，每天1次，每次15分钟，7天1个疗程，连续治疗2个疗程。每疗程结束后应用免疫组化法、实时荧光定量PCR法检测坐骨神经和相应脊髓段N etrin-1受体DCC的表达变化。结果电针治疗组大鼠与模型对照组比较，损伤坐骨神经、相应脊髓段DCC在第一疗程后表达均增强，后两疗程后有所降低，但前者始终强于后者，有非常显著性差异(P＜0.01)，且两组始终都强于空白对照组和假手术组，也有非常显著性差异(P＜0.01)。结论电针治疗能增强损伤的坐骨神经和相应脊髓段中Netrin1受体DCC的表达，可能是其治疗周围神经损伤的机制之一。

电针；坐骨神经损伤；神经生长导向因子Netrin-1；受体DCC；痹证；动物实验；环跳；足三里

周围神经损伤，是指周围神经干或其分支受到外界直接或间接力量作用而发生的损伤，属祖国医学“痿证”“痹证”等范畴，处于临床神经系统疾病针灸病谱中第三位[1]。目前本病困扰医患的问题是治疗后神经功能的恢复不能令人满意[2]，但有研究表明，电针疗效显著，可促使患者肢体神经功能的恢复[3-5]。在周围神经损伤后极其复杂的修复再生过程中，轴突的修复至关重要。我们前期研究发现，引导损伤的轴突向正确的方向和途径延伸的神经生长导向因子Netrin-1，在电针干预下表现出了和神经功能恢复的相关性[6]。但其下游因子，如其受体DCC等的研究还鲜见报道。因此，本文拟从此方面继续进一步探究电针治疗周围神经损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组清洁级雄性SD大鼠，体重200士20 g，70只，西安交通大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（陕）2007-001）。动物随机分成空白对照组（10只）、假手术组（20只）、模型对照组（20只）和电针治疗组（20只）。

1.2 模型制作大鼠10%水合氯醛(0.3ml/100 g)腹腔注射麻醉。行右后肢背侧纵切口，无菌条件下暴露并游离坐骨神经，于梨状肌下10 mm处将其锐性横断，两断端用10-0显微缝合丝线端对端缝合外膜3针，保持吻合口无张力，分层缝合肌肉和皮肤。造模后见大鼠右侧后肢无自主活动，不能支撑身体，右膝、踝、趾各关节不能屈曲而下垂，移动依赖其他肢体拖动，标志造模成功。

1.3 处理方法电针治疗组术后第2日，取“环跳”（后肢髋关节后上缘）、“足三里”（膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm），以0.19 mm×10 mm针灸针进针0.5 mm，以G6805-2型电针机，采用疏密波，频率为5 Hz治疗，强度以肌肉出现轻微抽动为度，每天1次，每次15 min，7天1个疗程，疗程间隔1天，共治疗2个疗程；其他组不做治疗，但与电针治疗组同样进行动物模拟抓取。

1.4 标本制备每1疗程结束后当天，将各组10只大鼠以过量水合氯醛深度麻醉，取其坐骨神经（缝合处近、远端各约1 cm，共约2 cm）和相应节段脊髓（L4～L6段，约2 cm）组织。

1.5 免疫组化检测将所取组织固定24 h，常规石蜡包埋，连续纵（坐骨神经）、横（脊髓）切片（片厚5 μm），SP法常规染色。免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。每组10例，每例检测3张切片，采用采用Zeiss ImergerA1显微镜和DXM1200FCCD图像采集系统观察并照相，光镜下DCC阳性反应物为突出背景的棕黄色颗粒，应用图像分析系统Image-Pro Plus5.1测定其积分光密度。

1.6 实时荧光定量PCR检测冰上所取组织用冰冻生理盐水冲洗，迅速置于液氮中保存后，转至-80℃冰箱保存。试剂和仪器RNA提取试剂盒，cDNA合成试剂盒，实时荧光定量核酸扩增检测系统（Quantitative real-time PCR）Super Mix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）。高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），7500型RT-PCR扩增仪（美国ABI公司），Nanodrop 2000C型核酸测定仪（美国Thermo公司）。引物设计与合成（武汉昆泰锐生物技术有限公司），DCC上游引物序列为：5’-CCACCCTTCCCAAGACTCAT-3’，下游引物序列为：5’-AAACTCGCCATTTGTTCGCT-3’，扩增长度为181bp。内参β-actin上游引物序列为：5’-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3’，下游引物序列为：5’-CACACAGAGTACTTGCGCTC-3’，扩增长度为238 bp。按RNA试剂盒抽提总mRNA，以逆转录试剂盒合成cDNA，再进行PCR扩增，反应条件PCR扩增反应条件：预热50℃2 min，预变性95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共40个循环。以2-△△Ct法计算目的基因相对的表达值。

1.5 统计分析所有数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS19.0 forwindows统计软件包进行Oneway-ANOVA分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测模型对照组与空白对照组、假手术组比较，大鼠损伤的坐骨神经和相应脊髓段中DCC积分光密度在第一疗程后达到高峰后降低，但仍高于后两组，都有非常显著性差异(P＜0.01)。电针治疗组与模型对照组比较，也在第一疗程后达到高峰后降低，但均强于后者，也都有非常显著性差异(P＜0.01)（见表1、2）。

2.2 实时荧光定量PCR检测模型对照组与空白对照组、假手术组比较，大鼠损伤的坐骨神经中DCC表达在第一疗程后达到高峰后降低，但仍高于后两组，有非常显著性差异(P＜0.01)。电针治疗组与模型对照组比较，也在第一疗程后达到高峰后降低，且均强于后者，也有非常显著性差异(P＜0.01)（见表3、4）。

表1 大鼠坐骨神经DCC蛋白免疫组化积分光密度（IOD）比较（±s）

表1 大鼠坐骨神经DCC蛋白免疫组化积分光密度（IOD）比较（±s）

注：与空白对照组、假手术组比较，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01；与模型对照组比较，★表示P＜0.05，★★表示P＜0.01。（下同）

组别n第1疗程（7 d）第2疗程（15 d）空白对照组假手术组模型对照组电针治疗组10 10 10 10 10321.55±785.54 10249.66±899.61 31041.25±2618.56▲▲38098.28±3094.65★★10479.54±852.21 10586.12±698.45 18786.47±1563.06▲▲29520.36±1809.39★★

表2 大鼠脊髓DCC蛋白免疫组化积分光密度（IOD）比较（±s）

表2 大鼠脊髓DCC蛋白免疫组化积分光密度（IOD）比较（±s）

组别n第1疗程（7 d）第2疗程（15 d）空白对照组假手术组模型对照组电针治疗组10 10 10 10 5208.77±368.15 5520.32±298.65 10654.09±961.81▲▲15003.22±1004.37★★5610.23±305.01 5126.60±198.50 9779.58±754.07▲▲11650.02±995.27★★

表3 大鼠坐骨神经DCC基因相对表达比较（±s）

表3 大鼠坐骨神经DCC基因相对表达比较（±s）

组别n第1疗程（7 d）第2疗程（15 d）空白对照组假手术组模型对照组电针治疗组10 10 10 10 1.00±0.02 1.00±0.03 1.45±0.04▲▲2.41±0.04★★1.00±0.03 1.00±0.01 1.24±0.05▲▲1.87±0.03★★

表4 大鼠脊髓DCC基因相对表达比较（±s）

表4 大鼠脊髓DCC基因相对表达比较（±s）

组别n第1疗程（7 d）第2疗程（15 d）空白对照组假手术组模型对照组电针治疗组10 10 10 10 1.00±0.02 1.00±0.01 1.35±0.07▲▲2.59±0.04★★1.00±0.02 1.00±0.03 1.18±0.05▲▲1.98±0.03★★

3 讨论

周围神经的修复再生极其复杂，影响因素众多，且相互关系微妙，目前鲜有关于电针和周围神经损伤再生修复的关键——轴突再生修复的研究[6]。而Cajal 1928年就发现“神经趋向性”：即神经生长突在发育、再生修复过程中，会受到来自外周组织释放的某些化学物质方向性的引导。目前已证实有四种重要的轴突生长导向分子家族：Slits、Netrins、Ephrins和Semaphorins[7]。其中Netrins是唯一长程性吸引性导向因子，是一类由中枢神经系统中线底板分泌的蛋白，吸引性受体为DCC（Deleted colorectal cancer，结肠癌缺失蛋白）[8、9]。Netrin在众多物种的神经系统均表达，神经轴突有促进生长锥生长与诱导生长锥迁移的作用，缺乏Netrin将使本应向中线生长的神经轴突发生方向性错误[10]。Netrin-1在成年大鼠脊髓神经元和少突胶质细胞中都有表达，且大多数不是以自由的可溶性分子存在，而是与细胞膜或细胞外基质相联系的非扩散性分子，主要富含于轴突周围髓鞘及轴膜上[11]。研究还发现netrin-1mRNA在正常大鼠坐骨神经中表达水平较低，坐骨神经横断性损伤2周后表达水平明显升高[12]。这与我们前期研究成果基本一致[6]。而Netrins受体DCC是膜结合的受体，包括胞外区、跨膜区TM和胞内区3个功能区。DCC蛋白介导神经轴突朝向Netrin蛋白方向生长，完成吸引性作用[8]。Netrin-1与其受体DCC结合后，在胚胎期可通过吸引和排斥的双重机制引导轴突生长和细胞迁徙，且参与对细胞凋亡的双向调节[9、10]。但电针对Netrin-1的影响是否波及到其受体DCC，目前鲜见报道。

中医学认为周围神经损伤其病机主要以气血不足、营卫不调为主。其针灸临床治疗常以“治痿独取阳明”为指导，常用“足三里”、“环跳”等穴。“足三里”穴属足阳明胃经，为本经合穴、胃的下合穴，是治疗下肢痿痹、半身不遂等病证要穴；“环跳”穴属足少阳胆经，是胆经与膀胱经的交会穴，也是治疗下肢痿痹要穴。统计分析针刺治疗坐骨神经痛1911年—2010年的临床文献发现，纳入的318篇文献中，选穴涉及13条经脉的123个穴位，“环跳”的使用频次最高，“足三里”也极高[13]。因此，本实验选取“环跳”、“足三里”来探究电针治疗周围神经损伤的机制。本实验中，坐骨神经损伤大鼠电针治疗后，损伤的坐骨神经和相应脊髓段中DCC表达强于模型对照组；模型对照组也强于空白组损伤和假手术组，均有非常显著性差异。本研究表明电针治疗能明显增强损伤的周围神经DCC蛋白的表达，但电针治疗如何影响信号通路——Netrin-1、DCC及其下游因子的表达则是一个非常复杂的问题，可能还牵涉到其他信号通路的众多因素。因此，电针能促进DCC蛋白的表达，可能是其促进轴突乃至周围神经损伤修复再生的一个方面，还需要更进一步的研究。

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Effects o f Electroacupun ctu re on Recep tor DCC o f Nerve G row th Guidance Facto r Netrin-1 o f Rats a fter Sciatic Nerve In ju ry

DU Xu,WANGRuihui,WANG Pengli,WANGYu,ZHANG Zhaoxing,CHEN Chaochao,LIUWenwen

(Departmentof Acupuncture and M assage,ShannxiUniversity of ChineseM edicine,ShaanxiProvince,Xianyang 712046,China)

ObjectiveTo discuss the effects on receptor DCC of nerve growth guidance factor Netrin-1 of rats after sciatic nerve injury.M ethods70 SD rats were random ly divided into control group,sham-operated group,model group and the electroacupuncture (EA)group(n=20).In the latter two groups,the right sciatic nerve was transected and end-to-end suture immediately.The treatmentof EA on"Huantiao"(GB 30)and'Zusanli'(ST 36)was applied once daily,and 7 dayswas a course of treatment,which included continuous treatment of two courses.The changes in expression of receptor DCC in sciatic nerve and corresponding section of spinal cord were detected by quantitative real-time PCR and immunohistochemicalmethods at the end of each course of treatment.Resu ltsEA group was compared with themodel group,DCC in the injured rat sciatic nerve and spinal cord segments reached a peak after the first course of treatment,then decreased gradually,were higher than themodel group,and therewas a remarkably significant difference(P＜0.01).The two groups were always higher than the control group and sham-operated group,and there were also remarkably significant differences(P＜0.01).ConclusionEA treatment can remarkably strengthen expression of DCC in sciatic nerve and corresponding section of spinal cord after sciatic nerve injury.Thismay be the one of themechanisms for the treatment of peripheral nerve injury.

electroacupuncture;sciatic nerve injury;nerve growth guidance Netrin-1;receptor DCC;bi syndrome;animal experiment; Huantiao(GB 30);Zusanli(ST 36)

：李海燕本文校对：刘海燕

2016-10-27）

陕西省中医药管理局科研项目【No：13-JC018】；陕西省教育厅专项科研计划项目【No：2013JK0825】

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.05.054

1672-2779（2017）-05-0128-03