忍冬藤总黄酮超声辅助提取工艺及其体外抗氧化活性研究

向极钎,王应玲,刘晓鹏,姜 宁,殷红清,王秋霜

(1.湖北民族学院生科院,湖北恩施 445000; 2.恩施清江生物工程有限公司,湖北恩施 445000;3.湖北省地质局第二地质大队,湖北恩施 445000;4.南京医药股份股份有限公司,博士后工作站,江苏南京 210012)

忍冬藤总黄酮超声辅助提取工艺及其体外抗氧化活性研究

向极钎1,2,王应玲3,刘晓鹏1,4,*,姜 宁1,殷红清2,王秋霜4

(1.湖北民族学院生科院,湖北恩施 445000; 2.恩施清江生物工程有限公司,湖北恩施 445000;3.湖北省地质局第二地质大队,湖北恩施 445000;4.南京医药股份股份有限公司,博士后工作站,江苏南京 210012)

本研究采用中心复合实验优化了超声辅助提取忍冬藤总黄酮的工艺;以 1,1-二苯基-二苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和2,2′-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS+·)清除能力,Fe2+螯合力和铁离子还原抗氧化力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)为指标,研究了忍冬藤总黄酮的体外抗氧化活性。结果表明:超声辅助提取忍冬藤总黄酮的最佳提取工艺为:乙醇浓度70%、液固比31∶1(mL/g)、超声功率210 W,超声时间8 min,按此工艺提取忍冬藤总黄酮,得率达7.74%±0.10%。体外抗氧化活性的研究显示忍冬藤总黄酮清除DPPH自由基的IC50为48.1 μg/mL、清除ABTS+自由基的IC50为66.1 μg/mL、Fe2+螯合力的EC50为83.6 μg/mL,在6.25～200 μg/mL的浓度范围内,FRAP 值与总黄酮的浓度呈线性关系:Y=0.0019x+0.1527(R2=0.9964)。此研究为忍冬藤总黄酮的进一步开发和利用提供了理论依据。

忍冬藤,总黄酮,超声辅助,抗氧化

忍冬藤为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥茎枝,分布广泛,忍冬藤与金银花为植物忍冬的不同药用部位,均收载于2010年版中国药典[1]。忍冬藤味甘、性寒,具有清热解毒,通络之功效。用于温病发热,疮痈肿毒,热毒血痢,风湿热痹[1]。现代研究表明,忍冬藤具有抗病毒[2]、抗炎[3]、抗肿瘤[4]以及调节免疫[5]等药理作用。

忍冬藤富含黄酮[6],黄酮具有多种药理功能,但目前对忍冬藤总黄酮的提取和体外抗氧化活性研究没有报道。本研究首次通过中心复合实验优化了超声辅助提取忍冬藤总黄酮的提取工艺,并以DPPH自由基清除力、ABTS+自由基清除力、Fe2+螯合力和铁离子还原抗氧化力(Ferric reducing antioxidant power,FRAP)为指标,检测忍冬藤总黄酮的体外抗氧化活性。该研究为忍冬藤总黄酮的工业化提取和进一步开发提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

忍冬藤 由南京同仁堂洪泽中药材科技有限公司提供,60 ℃烘干,粉碎,过60目筛;DPPH、ABTS+、菲咯嗪、TPTZ和Trolox 购自日本东京化成工业株式会社;葡萄糖、无水乙醇、蒽酮、硫酸等 均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。

TU-1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;RT-02A型多功能粉碎机 弘荃机械企业有限公司;JY96-Ⅱ超声波细胞粉碎机 宁波新芒生物科技股份有限公司;BECKMAN COUCTER型离心机 美国BECKMAN公司;HHS型恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;多功能酶标仪 Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制及总黄酮得率的计算 标准曲线的绘制及忍冬藤总黄酮得率的计算参照《中国药典》2010版[7]。以吸光度A为纵坐标、芦丁质量浓度C(mg/mL)为横坐标,绘制标准曲线方程。按如下公式计算总黄酮得率。

式中:c为测定样液的黄酮质量浓度(mg/mL);V为提取体积(mL);m为忍冬藤质量(mg)。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 乙醇浓度对黄酮得率的影响 称取一定量的忍冬藤粉末,按液固比20∶1(mL/g)分别加入浓度为50%、60%、70%、80%和90%的乙醇,超声处理4 min,超声功率为150 W。将浸提液4000 r/min离心30 min,测上清液中的总黄酮含量,计算得率。

1.2.2.2 液固比对黄酮得率的影响 将一定量的忍冬藤粉末,分别按液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1(mL/g)加入70%的乙醇溶液,150 W超声处理4 min,然后将浸提液4000 r/min离心30 min,上清测总黄酮含量,计算得率。

1.2.2.3 超声功率对黄酮得率的影响 按液固比20∶1(mL/g)加入70%的乙醇溶液,分别用功率为50、100、150、200、250、300 W的超声波处理4 min。超声处理后,将提取液4000 r/min离心30 min,上清测总黄酮含量,计算得率。

1.2.2.4 超声时间对黄酮得率的影响 按液固比20∶1(mL/g)向忍冬藤粉末中加入70%乙醇溶液,超声功率150 W,分别处理2、4、6、8、10、12 min。然后,4000 r/min离心30 min,取上清测总黄酮含量,计算得率。

1.2.3 中心复合实验优化忍冬藤总黄酮提取工艺 根据单因素实验结果,采用Design-Expert 8.0软件进行中心复合实验设计,以乙醇浓度、液固比、超声功率和超声时间为自变量,黄酮得率为响应值以优化忍冬藤黄酮的提取工艺。实验因素水平设计见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 Factors and levels table

根据中心复合实验,建立乙醇浓度、液固比、超声功率和超声时间与总黄酮得率的回归方程,并进行响应面分析,优化出忍冬藤总黄酮提取的最佳工艺,并对优化的工艺进行验证,以证明此工艺是否可行。

1.2.4 忍冬藤总黄酮体外抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的测定 将100 μL不同浓度的测试样品和VC及Trolox溶液与100 μL 0.1 mol/L的DPPH·溶液加入到96孔培养板的孔内,摇匀,室温下暗处静置 30 min 后测定其517 nm处的吸光值,以同时测定100 μL DPPH·溶液与100 μL溶剂混合后的吸光度为对照。DPPH自由基清除率计算如下:

其中,As为样品或阳性对照的吸收值,Ac为空白对照的吸收值[8]。

1.2.4.2 ABTS+自由基清除能力的测定 忍冬藤总黄酮ABTS+自由基清除能力的测定按参考文献[9]进行。具体操作如下:将25 mL 7 mmol/L ABTS+与440 μL 140 mmol/L的过硫酸钾(K2S2O8)溶液配匀,在避光处放置12～16 h,使用时用去离子水或90%乙醇稀释至734 nm处的吸光值为0.7±0.02,ABTS+·工作液现配现用。将不同浓度的样品或阳性对照溶液取50 μL加入96孔板中,加入ABTS+·溶液150 μL,混匀10 min后,测734 nm处吸光度,以去离子水或90%乙醇50 μL加ABTS+·溶液150 μL为空白对照。ABTS+自由基清除率计算公式如下:

式中,As为样品的吸光值,Ac为空白对照的吸光值。

1.2.4.3 Fe2+螯合力的测定 Fe2+螯合力的方法参考文献[10]。主要操作如下:吸取50 μL不同浓度的待测液(样品和EDTA-2Na溶液),加入5 μL氯化亚铁溶液(2 mmol/L),160 μL去离子水,室温振荡反应5 min后,加入10 μL菲咯嗪溶液(5 mmol/L,溶于甲醇),摇匀,室温反应10 min,于562 nm处测吸光值。

其中Ac为空白吸光值,As为不加菲咯嗪时的吸光值。

1.2.4.4 铁离子还原抗氧化力(Ferric reducing antioxidant power,FRAP)的测定 标准品或待测样品(10 μL),混合于200 μL的ferric-TPTZ试剂(300 mmol/L pH3.6的醋酸缓冲液,溶于40 mmol/L HCl的10 mmol/L TPTZ,20 mmol/L的 FeCl3·6H2O溶液按体积比10∶1∶1混合),然后加入96孔板中。微板于37 ℃ 孵育30 min后,于593 nm处测吸光值。吸收值越高,还原性越强[11]。

1.3 数据分析

所有实验均重复三次,单因素实验数据和体外抗氧化活性数据均以平均数±标准误(SE)表示,采用统计软件 Origin 8.0进行单因素方差分析,组间差异比较采用Tukey实验;中心复合实验结果由Design-Expert 8.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 忍冬藤总黄酮提取工艺优化

2.1.1 单因素实验

2.1.1.1 乙醇浓度对忍冬藤总黄酮得率的影响 乙醇浓度对忍冬藤总黄酮得率的影响如图1所示,随着乙醇浓度的增加,总黄酮得率也显著增加,当乙醇浓度增至70%后,黄酮的得率升高不再显著。说明忍冬藤总黄酮在70%乙醇溶液中已大部分溶出,提取乙醇浓度不再会使总黄酮溶解。

图1 乙醇浓度对忍冬藤总黄酮得率的影响 Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae注:不同大写字母表示差异极显著,p<0.01;不同小写字母表示差异显著,p<0.05;图1～图4同。

2.1.1.2 液固比对忍冬藤总黄酮得率的影响 图2为液固比对忍冬黄酮得率影响的结果,从图2可以看出,液固比较小(<20∶1)时,增加提取液的体积,对黄酮得率影响显著(p<0.01),当液固比>30∶1时,黄酮的得率不再显著上升,当液固比超过40∶1后,得率有下降趋势。这是因为液固比增加,可以增加忍冬藤细胞内的黄酮与溶液中黄酮的浓度差,从而增加溶出量,但当浸提液体积过大,会使后续操作困难和浪费增加,从而使得率下降。

图2 液固比对忍冬藤总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

2.1.1.3 超声功率对忍冬藤总黄酮得率的影响 超声功率也能显著影响忍冬总黄酮的得率(图3),超声功率较低时,提高功率能极显著提高总黄酮得率(p<0.01),当超声功率达200 W后,总黄酮得率不再显著上升,至300 W时,得率反而下降。这是因为提高超声功率能增强超声波的空化作用,从而促进黄酮的溶出,但功率过大,反而会破坏黄酮的结构或增加其它物质的溶出从而抑制黄酮的得率。

图3 超声功率对忍冬藤总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

2.1.1.4 超声时间对忍冬藤总黄酮得率的影响 超声时间也显著影响着忍冬藤黄酮的得率(图4)。当超声时间较短时(<8 min),随着时间的延长,黄酮的得率显著升高(p<0.01),但当提取时间超过8 min后,黄酮的得率不再提高。

表2 中心复合实验结果 Table 2 Results of central composite test

图4 超声时间对忍冬藤总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

2.1.2 中心复合实验

2.1.2.1 回归模型的建立和检验 中心复合实验优化忍冬藤总黄酮提取工艺的结果如表2所示。经统计软件Design-Expert 8.0分析,建立了如下四元二次回归方程:

R=7.52-0.44A+0.30B+0.74C+0.20D-0.20AB+0.24AC+0.30AD+0.11BC-0.034BD-0.53CD-0.74A2-0.75B2-0.86C2-0.59D2,R2=0.9600。

方差分析结果列于表3中。从表3中可能得出,该模型显著水平为极显著,失拟实验为不显著(p>0.05),说明此回归模型与实际情况拟合得很好。根据各项偏回归系数的绝对值大小,可以判断出各因素对黄酮得率影响程度大小顺序为C2>B2>A2>C>D2>A>CD>B>AD>D>AC>AB>BC>BD,其中AB、BC、BD项不显著(p>0.05),所以将上述回归模型的这三项删除,最终回归模型如下:

R=7.52-0.44A+0.30B+0.74C+0.20D+0.24AC+0.30AD-0.53CD-0.74A2-0.75B2-0.86C2-0.59D2,R2=0.9227。

2.1.2.2 黄酮提取工艺优化及验证 根据建立的回归模型,计算得出当A=-0.28,B=0.27,C=0.45,D=-0.12,即乙醇浓度68.6%,液固比31.4∶1(mL/g),超声功率211.2 W,超声时间7.9 min,黄酮的得率最高,理论值为7.77%。为了操作方便,将工艺定为乙醇浓度70%、液固比31∶1(mL/g)、超声功率210 W,超声时间8 min,按此工艺提取忍冬藤总黄酮,得率达7.74%±0.10%,与理论值接近度高,说明该工艺具有较强的使用价值。

2.1.2.3 两因素间交互作用 作用显著的两因素间的交互作用如图5～图7所示,三组图直观地反映了当其它两个因素处于最佳水平时,乙醇浓度和超声功率、乙醇浓度和超声时间、超声功率和超声时间的交互作用对忍冬藤总黄酮得率的影响。

图5表示当液固比为31.4∶1(mL/g),超声处理7.9 min时,乙醇浓度和超声功率对忍冬藤总黄酮得率的影响。图中显示,当乙醇浓度和超声功率较低时,总黄酮得率很低,随着二者的上升,得率显著增加,当乙醇浓度达65%～70%,超声功率200～225 W之间时,总黄酮得率最高。

图5 乙醇浓度和超声功率对忍冬藤总黄酮得率的影响Fig.5 Interactive effects of ethanol concentration and ultrasonicpower on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

图6为液固比为31.4∶1(mL/g),超声功率211.2 W时,乙醇浓度和超声时间交互作用对总黄酮得率的影响。如图所示,只有乙醇浓度和超声时间分别在65%～70%和7～8 min范围内,总黄酮的得率才能达到最高值,任何因素的升高或下降都会降低得率。

表3 中心复合实验结果方差分析表Table 3 ANOVA of central composite test results

图6 乙醇浓度和超声时间对忍冬藤总黄酮得率的影响Fig.6 Interactive effects of ethanol concentration and ultrasonictime on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

*:差异显著(p<0.05);**:差异极显著(p<0.01)。当乙醇浓度为68.6%、液固比31.4∶1(mL/g)时,超声功率和超声时间对得率的交互影响如图7所示。可以得知:当超声功率较低、超声时间很短时,黄酮的得率极低;随着二因素的水平的提高,得率急剧上升,当超声功率达200～225 W、提取时间7～8 min,得率达极大值;而进一步提高超声功率、延长超声处理时间,得率反而缓缓下降。

图7 乙醇浓度和超声时间对忍冬藤总黄酮得率的影响Fig.7 Interactive effects of ultrasonic power and ultrasonictime on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

2.2 忍冬藤总黄酮体外抗氧化活性研究

2.2.1 DPPH自由基清除能力 忍冬藤总黄酮DPPH清除能力如图8所示。样品与标准品(Trolox和VC)的DPPH自由基清除率均呈剂量依赖性,Trolox的清除率与浓度(0.94～30 μg/mL)的线性方程为y=2.6964x+5.5816,R2为0.9982;VCDPPH自由基清除率与浓度(1.56～80 μg/mL)的回归方程为y=1.1442x+3.1050,R2为0.979;样品忍冬藤总黄酮的DPPH自由基清除率与浓度(3.75～120 μg/mL)的关系可用如下回归方程表示:y=0.7573+13.584,R2为0.9345。三者的IC50分别为16.5、41.0、48.1 μg/mL。说明,其中Trolox的DPPH自由基清除能力最强,忍冬藤总黄酮的DPPH自由基清除能力与VC相当。

图8 忍冬藤总黄酮DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging capacity of total flavonoids from Caulis Lonicerae

2.2.2 ABTS+自由基清除能力 图9为忍冬藤总黄酮ABTS+自由基清除能力的测定结果。Trolox表现出极强的ABTS+自由基清除能力,清除率与浓度(0.47～15 μg/mL)的线性回归方程是 y=6.227x-0.8917,R2为0.9959;VCABTS+自由基清除率与浓度(3.13～100 μg/mL)的关系为 y=0.886x+5.507,R2为0.9726;而忍冬藤总黄酮ABTS+自由基清除率与其浓度(4.69～150 μg/mL)的关系为 y=0.5745x+12.04,R2则是0.9572。计算它们的IC50值,得出:Trolox 8.2 μg/mL、VC50.2 μg/mL、忍冬藤总黄酮 66.1 μg/mL。

图9 忍冬藤总黄酮ABTS+自由基清除能力 Fig.9 ABTS radical scavenging capacity of total flavonoids from Caulis Lonicerae

2.2.3 Fe2+螯合力的测定 以EDTA-2Na为标准品,通过菲咯嗪试剂,测定忍冬藤总黄酮的Fe2+螯合能力(图10)。标准品和样品的Fe2+螯合力均与剂量相关,其中EDTA-2Na的Fe2+螯合率与浓度(2.81～90 μg/mL)的线性关系可表示为:y=1.0147x+9.6334,R2为0.9719;忍冬藤总黄酮的Fe2+螯合率与浓度(2.34～150 μg/mL)的线性关系则为:y=0.5535x+3.7404,R2=0.9874。通过线性回归方程计算它们的EC50值,分别为39.8 μg/mL(EDTA-2Na),83.6 μg/mL(样品)。所以,忍冬藤总黄酮的Fe2+螯合能力约为EDTA-2Na的50%。

图10 忍冬藤总黄酮Fe2+螯合能力Fig.10 Fe2+chelating ability of total flavonoids extraction from Caulis Lonicerae

2.2.4 FRAP测定 以Trolox和VC为标准品,测定忍冬藤总黄酮的FRAP值,可以发现,两种标准品和忍冬藤总黄酮的FRAP值均呈浓度依赖性(图11)。在3.75～120 μg/mL浓度范围内,Trolox的OD与浓度呈线性关系,线性方程为:y=0.006x+0.0015(R2=0.9923);在4.38～140 μg/mL浓度范围内,VC的OD值与浓度的线性关系为:Y=0.0055x-0.0202(R2=0.9952);对于忍冬藤总黄酮来说,在6.25～200 μg/mL的浓度范围内,OD与浓度的线性关系可以表示为:Y=0.0019x+0.1527(R2=0.9964)。

图11 忍冬藤总黄酮FRAP的测定Fig.11 FRAP assay of total flavonoids from Caulis Lonicerae

3 结论

本研究采用单因素实验结合响应面分析优化了忍冬藤总黄酮的超声辅助提取工艺,优化的工艺为乙醇浓度70%、液固比31∶1(mL/g)、超声功率210 W,超声时间8 min,按此工艺提取忍冬藤总黄酮,得率达7.74%±0.10%。前期,本实验室曾优化了水浴法的忍冬藤总黄酮工艺,得率为5.22%[12],因此,超声辅助提取的总黄酮得率较普通水浴法的

得率提高了40.22%。通过对DPPH自由基清除力、ABTS+自由基清除力、Fe2+螯合力和FRAP的体外抗氧化指标的测定,表明忍冬藤总黄酮具有较强的体外抗氧化活性。该研究为忍冬藤这一传统中药的进一步开发提供了理论依据。对忍冬藤总黄酮的体内抗氧化活性和其中具体成分的研究是本课题组下一步的目标。

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M].2010版. 一部. 北京:中国医药科技出版社,2010:179.

[2]周虎,俞庆福.忍冬藤对慢性乙型病毒性肝炎血浆内皮素的影响[J].临床军医杂志,2002,30(6):25-26.

[3]童惠云,熊源胤,李建武,等. 五藤汤辨治类风湿性关节炎[J].中医药临床杂志,2007,19(4):321-322.

[4]姚存姗,伍期专. 忍冬藤提取物光敏化作用的初步研究[J].中国激光医学杂志,2006,15(6):361-364.

[5]孙志平,马宁宁,丁樱,等.丁樱教授配伍应用鸡血藤和忍冬藤经验[J].中国中西医结合儿科学,2010,2(6):503-504.

[6]陈 玲,张海艳,李晓,等. 忍冬的化学成分研究进展[J]. 现代药物与临床,2015,30(1):108-114.

[7]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 2010版. 一部. 北京:中国医药科技出版社,2010:355.

[8]Chen D,Fan J,Wang P,et al. Isolation,identification and antioxidative capacity of water-soluble phenylpropanoid compounds from Rhodiola crenulata[J]. Food Chemistry,2012,134(4):2126-2133.

[9]Lv J,Yu L,Lu Y,et al. Phytochemical compositions,and antioxidant properties,and antiproliferative activities of wheat flour[J]. Food Chemistry,2012,135(2):325-331.

[10]Tuba Ak,Gülcin I. Antioxidant and radical scavenging properties of curcumin[J]. Chemico-Biological Interactions,2008,174(1):27-37.

[11]Fernandes VC,Domingues VF,Freitas V,et al. Strawberries from integrated pest management and organic farming:Phenolic composition and antioxidant properties[J].Food Chemistry,2012,134(4):1926-1931.

[12]姜宁,刘晓鹏,张俊霞,等. 响应面法对忍冬藤总黄酮提取工艺的优化[J].湖北农业科学,2015,54(10):2459-2462.

Ultrasound-assisted extraction and antioxidant activitiesinvitroof total flavonoids fromCaulisLonicerae

XIANG Ji-qian1,2,WANG Ying-ling3,LIU Xiao-peng1,4,*,JIANG Ning1,YIN Hong-qing2,WANG Qiu-shuang4

(1.School of Biological Science and Technology,Hubei Institute for Nationalities,Enshi 445000,China;2. Enshi QingJiang Bio-Engineering Co.,Ltd.,Enshi 445000,China;3. No.2 Geological Brigade of Geological Department of Hubei Province,Enshi 445000,China;4. Postdoctoral Research Station,Nanjing Medical Co.,Ltd.,Nanjing 210012,China)

The optimization of ultrasound-assisted extraction process of total flavonoids fromCaulisLoniceraewas investigated by response surface methodology(RSM)based on central composite design and the antioxidant activitiesinvitroof the extracted flavonoids was measured using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH·)scavenging,2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid(ABTS+·)radical scavenging,Fe2+chelating activity and ferric reducing antioxidant power(FRAP)methods. The results showed that the optimal ultrasound-assisted extraction conditions for total flavonoids fromCaulisLoniceraewere obtained as follows:ethanol concentration was 70%,liquid-solid ratio 31∶1(mL/g),ultrasonic power 210 W,ultrasonic time 8 min. Under these conditions,the yield of total flavonoids was 7.74%±0.10%. The extracted flavonoids exhibited powerful antioxidant activitiesinvitro. The IC50of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH radical)scanvenging and ABTS+radical scanvenging capcities were 48.1,66.1 μg/mL,respectively. The EC50of Fe2+chelating ability was 83.6 μg/mL,and in the concentration range of 6.25～200 μg/mL,the linear regression equation of relationship between TRAP value and total flavonoids concentration from was as follow:Y=0.0019x+0.1527(R2=0.9964). This research might provide a theoretical basis for the further development and utilization of total flavonoids fromCaulisLonicerae.

CaulisLonicerae;total flavonoids;ultrasound-assisted;antioxidant

2015-10-09

向极钎(1968-)，男，高级农艺师，研究方向：天然产物研究，E-mail:hmxjq@163.com。

*通讯作者:刘晓鹏(1971-)，男，教授，研究方向：天然产物研究，E-mail:18913386031@189.cn。

国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAI04B04-5)资助；江苏省“企业博士后集聚计划”项目(2011033)资助；2013年湖北省战略性新兴(支柱)产业人才培养(2013029)项目资助；2014年度湖北省本科高校“专业综合改革”试点项目(2014029)资助。

TS201.1

B

1002-0306(2017)02-0251-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.040