一种新型黄原胶裂解酶的异源表达及酶学性质表征

杜元元,郭小宇,李 鹤,王亚芳,杨 帆,李宪臻

(大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034)

一种新型黄原胶裂解酶的异源表达及酶学性质表征

杜元元,郭小宇,李 鹤,王亚芳,杨 帆*,李宪臻

(大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034)

黄原胶裂解酶是一种黄原胶修饰酶,对黄原胶的改性及新型黄原胶寡糖的制备具有十分重要的意义。本实验从一株性能优良的黄原胶降解菌Microbacteriumsp. XT11中首次克隆出黄原胶降解酶编码基因xly。该基因编码理论分子量为122027 u的蛋白质,其N端含有一条35 aa的分泌信号肽,C端含有一段392 aa的碳水化合物结合域CBM。随后,在去除分泌信号肽及CBM的截短酶的N端融合了谷胱甘肽巯基转移酶亲和纯化标签(GST),所形成的融合蛋白XLY-GST能够在大肠杆菌BL21(DE3)中高水平可溶表达。纯化的XLY-GST表现出与天然黄原胶裂解酶一致的酶学性质,其最适作用温度为40 ℃,最适pH为6.0,对碱性环境具有一定的耐受力(最高耐受pH10.5)。Ca2+和Mn2+对该裂解酶有显著地激活作用,而Cu2+则对该酶有一定的抑制作用。XLY-GST对黄原胶侧链的乙酰基和丙酮酸基团修饰程度表现出较高的特异性。本实验所取得的研究结果对黄原胶裂解酶的制备及黄原胶侧链修饰的研究奠定了基础。

黄原胶裂解酶,黄原胶修饰,酶学性质

黄原胶(xanthan)是一种重要的阴离子杂多糖,是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris)经发酵生成[1-2]。黄原胶的主链是β-(1,4)-糖苷键相连接而成的类纤维素结构,侧链则由β-D-甘露糖-(1,4)-β-D-葡萄糖醛酸-(1,2)-α-D-甘露糖连接组成(图1)[3-6]。黄原胶在工业上被广泛地用作增稠剂、乳化剂、成型剂、稳定剂、分散剂等[7]。

有研究表明,黄原胶侧链末端甘露糖残基的移除会导致其粘度下降,使黄原胶分子获得新的性状[8-9];此外,由侧链截断的黄原胶降解所产生的寡糖对黑腐病的防治具有多重功效,是一种有潜在价值的黑腐病生物农药[10-11]。目前,研究人员主要通过不同的X.campestris突变株发酵来获得具有不同侧链结构的黄原胶,但其产量无法满足工业化需求[9,12]。因此,基于黄原胶的特殊分子结构,开发能够水解其侧链的酶制剂以获取改性黄原胶不失为一种更有效、更有前景的研究手段。

作为一种黄原胶侧链修饰酶,黄原胶裂解酶(xanthan lyase,XLY,EC 4.2.2.12)通过β消减反应来实现黄原胶侧链中葡萄糖醛酸与甘露糖之间α-1,2糖苷键的切割(图1)[13-14]。目前为止,已报道的黄原胶裂解酶主要从其天然生产菌株,如PaenibacillusalginolyticusXL-1及Bacillussp. GL1中直接纯化获得,其纯化过程繁琐、成本较高,且纯酶的产量较低,无法满足黄原胶改性所需的酶量[15-16]。因此,本实验对一株性能优良的黄原胶降解菌Microbacteriumsp. XT11中黄原胶裂解酶编码基因进行克隆,利用大肠杆菌表达系统对该酶进行高水平表达纯化并进行酶学性质表征,旨在为工业上黄原胶侧链的酶法改性提供有效、可靠的酶制剂生产方法。

图1 黄原胶的化学结构[13]Fig.1 Chemical structure of xanthan[13]注:黄原胶裂解酶切割位点为箭头所示;Glc代表D-葡萄糖;Man代表D-甘露糖;GlcA代表D-葡萄糖醛酸。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

微杆菌Microbacteriumsp. XT 11 本实验室从土壤中分离获得并保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC AB2016011)[11];质粒PMD18-T Simple Vector、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、DNA Marker、限制性内切酶BamHI和EcoR I TaKaRa生物工程(大连)有限公司;质粒pGEX-2T 本实验室保存;大肠杆菌EscherichiacoliDH5α和E.coliBL21(DE3) 中科院大连物理化学研究所赵宗保研究员课题组;质粒小量快速提取试剂盒、基因组抽提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒、DpnI、还原性谷胱甘肽 上海生工生物工程有限公司;亲和层析填料Glutathione Sepharose 4B填料 GE公司;其他化学试剂 均为国产分析纯;引物合成与DNA测序分析 上海生工生物工程有限公司。

梯度PCR仪(vapo.protect)、电穿孔仪(Multiporator)、台式离心机(5804R) 德国Eppendorf公司;微量分光光度计(NanoVue plus)、蛋白质纯化系统(AKTA Prime plus)、SE260-10A-75型蛋白质垂直电泳槽 美国GE Healthcare Life Science公司;UV-5200型紫外/可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;DKB-1906型低温恒温槽 上海精宏实验设备有限公司;JY98-ⅢN型超声细胞破碎仪 宁波新芝生物科技有限公司。

1.2 培养基

黄原胶发酵培养基(1 L):黄原胶 3 g,葡萄糖 0.5 g,酵母浸粉 3 g,溶解于无机盐溶液,pH7.0。无机盐溶液(1 L):MgSO425 mg,K2HPO450 mg,KNO3700 mg,NaCl 800 mg,固体培养基添加琼脂粉15 g/L,用于XT11的发酵培养。LB培养基(1 L):胰蛋白胨(Oxid,Hampshire,England)10 g,酵母提取物(Oxid)5 g,NaCl 10 g,固体培养基添加琼脂粉15 g/L,用于大肠杆菌的培养,根据质粒的选择性标记需要,添加终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素。

1.3 实验方法

1.3.1 黄原胶裂解酶编码基因xly的克隆及表达载体的构建 取摇床培养12 h的Microbacteriumsp. XT 11新鲜发酵菌液,于4 ℃,4000×g离心收集菌体,随后采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA并以之为模板进行黄原胶裂解酶全长编码基因的扩增。基因扩增上游引物为5′-ATGAGGACGAAGATGTT CAGGATC-3′,下游引物为5′-CTACTCGATGGC GGAGACCAGCTG-3′。PCR反应体系如下:100 ng XT 11基因组DNA,10 μL 5×Primer STAR Buffer,20 μmol/L引物,2.5 mmol/L dNTPs,1.25 U Prime STAR HS DNA聚合酶,加水至总体积为50 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,61 ℃ 45 s,72 ℃ 3.5 min,30个循环,72 ℃ 10 min,4 ℃结束反应。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,采用凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收。将回收的黄原胶裂解酶编码基因片段通过TA克隆连接至pMD18-T Simple Vector构建质粒pT-xly并进行测序验证。采用数据库NCBI BLAST程序及DNAStar MegAlign软件对基因序列进行比对分析,利用在线分析软件SignalP 4.1对基因的分析信号肽进行分析。

以质粒pT-xly为模板,设计上游引物(5′-CGGGATCCGACATGCCTCACAGCACGAGCGTCGTCG-3′,下划线部分为BamHI识别位点)和下游引物(5′-CGGAATTCGATCATCCCGACGTTCTTCTGAG-3′,下划线部分为EcoRI识别位点)进行去除分泌信号肽及碳水化合物结合单元(carbohydrate binding module,CBM)的黄原胶裂解酶基因片段的扩增。PCR反应体系及反应条件基本同上(72 ℃延伸时间缩短为2.5 min)。将回收后的扩增产物和质粒pGEX-2T利用BamHI和EcoRI进行双酶切,将回收的酶切片段与质粒按照浓度比为1∶3的比例进行16 ℃连接过夜,转化至E.coliDH5α感受态细胞中,涂布于含终浓度为100 μg/mL 氨苄青霉素的LB平板,挑选阳性克隆并进行BamH I 和EcoR I双酶切验证鉴定,正确重组质粒命名为pGEX-xly。重组质粒的构建路线如图2所示。

图2 黄原胶裂解酶表达载体pGEX-xly构建路线图Fig.2 Schematic description on the construction of pGEX-xly

1.3.2 黄原胶裂解酶的异源表达及纯化 将重组质粒pGEX-xly热激转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,挑取鉴定正确的克隆进行黄原胶裂解酶的诱导表达。表达菌液于37 ℃摇床培养至OD600 nm为0.6时加入IPTG至终浓度为0.5 μmol/L,再于16 ℃诱导培养12 h。利用超声破碎仪对诱导菌体进行破碎,破碎上清液为粗酶液。

由于重组质粒pGEX-xly诱导表达黄原胶裂解酶的N端融合有GST标签,本实验利用Glutathione Sepharose 4B填料对该融合酶进行亲和纯化。具体步骤如下:取5 mL填料置于50 mL离心管中,500×g,5 min,小心移出上清液;将25 mL Binding Buffer(NaCl 140 mmol/L,KCl 2.7 mmol/L,KH2PO41.8 mmol/L,Na2HPO410 mmol/L,pH7.3)加入上述离心管中,轻轻混匀,500×g,5 min,小心移出上清液;将含有约25 mg总蛋白质的酶液加入填料中,轻轻混匀,室温结合2 h,500×g离心5 min,小心移出上清液;随后,再加入25 mL Binding Buffer,轻轻混匀,500×g离心5 min,小心移出上清液,并重复该步骤直到填料上的非结合蛋白基本被清洗了下来;最后加入2.5 mL Elution Buffer(Tris 50 mmol/L,还原性谷胱甘肽10 mmol/L,pH8.0)洗脱目的蛋白,室温放置5～10 min,500×g,5 min,小心移出含有目的蛋白的酶液。

所有蛋白质样品均采用SDS-PAGE电泳进行分析,蛋白质浓度测定采用Bradford法[17]。

1.3.3 黄原胶裂解酶酶活测定 反应体系中含有0.1 mg/mL的黄原胶溶液(溶于100 mmol/L PBS,pH6.0)和适当稀释的酶液(对照组为沸水灭活酶液)。酶反应于40 ℃进行30 min,沸水浴10 min终止反应,测定A235 nm的吸光值。一个黄原胶裂解酶酶活力单位定义为在上述反应条件下,每分钟235 nm处吸光值增加1.0所需要的酶量[16]。

1.3.4 酶的最适温度及热稳定性测定 纯化后的裂解酶液的最适温度测定实验是分别在30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃温度下进行酶反应,测定A235 nm的吸光值。以测定最高的酶活力为100%,计算各温度下的相对酶活力;将纯化后的裂解酶液分别在25、30、35、40、45、50、60、70 ℃温度下温育1 h后测定残余酶活力,测定最高的酶活力为100%,计算相对酶活力,绘制酶温度稳定性曲线。

1.3.5 酶的最适pH及pH稳定性测定 酶的最适pH是将纯化后的裂解酶液分别用缓冲液调节pH为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0,再于40 ℃与黄原胶底物反应30 min,沸水浴10 min终止反应,测定A235 nm的吸光值。以测定最高的酶活力为100%,计算各温度下的相对酶活力;酶的pH稳定性测定实验是将纯化后的裂解酶液分别在不同的pH缓冲液中温育2 h,而后在pH6.0、40 ℃条件下反应30 min,以测定最高的酶活力为100%,计算相对酶活力。其中,pH4.5～6.0采用0.1 mmol/L的乙酸钠缓冲液进行调节;pH6.0～8.0采用0.1 mmol/L的磷酸钾缓冲液进行调节;pH8.0～12.0采用0.05 mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液进行调节。

1.3.6 金属离子对酶活力影响的测定 在纯化后的黄原胶裂解酶反应体系中分别加入的不同金属离子,包括K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Li+,至终浓度为10 mmol/L,随后在pH6.0、40 ℃条件下进行酶反应,以未加入金属离子的酶液活力为对照(记为100%)计算相对酶活力。

1.3.7 黄原胶的纯化及不同化学修饰 首先,将黄原胶粉末溶解于超纯水中至终浓度为1 g/L,随后加入等体积的冰冷无水乙醇以及终浓度100 g/L的NaCl,于4 ℃搅拌2 h,过滤收集黄原胶沉淀并用95%乙醇清洗,最后干燥至恒重;5 g/L的纯化黄原胶溶液加入三氟乙酸至终浓度为5 mmol/L,随后溶液于100 ℃加热1.5 h以去除黄原胶侧链的丙酮酸基团;将黄原胶溶解于0.1 mol/L的NH4OH至终浓度为2.5 g/L,于60 ℃加热1.0 h以去除黄原胶侧链的乙酰基基团[3,18-19]。不同黄原胶样品中乙酰基和丙酮酸基团的含量按照文献报道方法进行测定[20-21]。以纯化黄原胶为底物测定的纯酶活力为对照(记为100%),计算以不同化学修饰黄原胶为底物的相对酶活力。

1.4 数据处理

本实验中所有实验均做3个平行样,3个平行数据的平均值、标准偏差及图表采用OriginLab OriginV 7.5(Northampton,MA,USA)软件进行计算绘制,数据的显著性差异则利用SPSS 17.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 黄原胶裂解酶编码基因xly的扩增及序列分析

以黄原胶降解菌Microbacteriumsp. XT 11的基因组DNA为模板,PCR扩增黄原胶裂解酶编码基因,琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。在3.5 kbp附近扩增出一条特异性条带,大小与黄原胶裂解酶目的基因片段一致。将回收的PCR产物送至上海生工测序,测序结果经NCBI数据库比对证明为黄原胶裂解酶的编码基因,大小为3546 bp,该基因编码的黄原胶裂解酶含有1182个氨基酸残基,理论分子量为122027 u。其N端含有一条35 aa的分泌信号肽,其C端含有一段大小为392 aa的碳水化合物结合域CBM(图4)。

图3 PCR扩增黄原胶裂解酶编码基因的1%琼脂糖凝胶电泳验证Fig.3 Agarose gel(1%)electrophoresis results of the xanthan lyase coding gene fragment注:泳道1为裂解酶目的条带;泳道M为DNA Marker。

图4 来源于不同物种的黄原胶裂解酶氨基酸序列比对Fig.4 Amino acid sequence alignment of xanthan lyases from different organisms注:白色区域代表高同源性序列区;灰色箭头注释区域为分泌信号肽;波浪线注释区域为CBM。

黄原胶裂解酶氨基酸序列比对结果表明,XT11的裂解酶与来源于Bacillusgobiensis、Microbacteriumtestaceum、Paenibacillusalginolyticus、Paenibacillussp. 1ZS3-15的黄原胶裂解酶的同源性分别为:47.3%、63.7%、45.5%(P.alginolyticusXalA)、49.3%(P.alginolyticusXalB)和41.7%。其中,来自同一属的M.testaceum与本实验所研究的XT 11具有较高的裂解酶序列相似性。

2.2 黄原胶裂解酶表达载体及菌株构建

日本学者相继从芽孢杆菌Bacillussp. Strain GL1和类芽孢杆菌PaenibacillusalginolyticusXL-1中纯化出两种黄原胶裂解酶,其分子量分别为75 ku和85 ku,酶反应最适温度分别为50 ℃和55 ℃,最适pH分别为5.5和6.0[15-16]。由于直接从黄原胶降解菌中纯化黄原胶裂解酶的过程过于繁琐且纯化效率较低,使得目前该酶的酶学性质相关表征工作进展缓慢。Ruijssenaars等[23]对P.alginolyticusXL-1的黄原胶裂解酶基因进行了克隆,并利用大肠杆菌pET系统进行了异源表达,但由于大部分目的蛋白质以包涵体形式存在,表达结果并不十分理想。因此,本实验致力于利用大肠杆菌表达体系来高水平异源表达黄原胶裂解酶,并通过亲和纯化技术实现纯酶的高效回收。已有工作指出,去除黄原胶裂解酶C端的CBM区域对于该酶的酶活力并无显著影响[14]。因此,本实验将黄原胶裂解酶全长基因中编码CBM的序列去掉,同时去除N端的分泌信号肽,剩下的截短基因片段(2133 bp)用于大肠杆菌表达载体的构建。

将BamHI和EcoRI双酶切的黄原胶裂解酶截短DNA片段及表达载体pGEX-2T于16 ℃连接过夜,连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中。挑取氨苄青霉素抗性平板上的阳性克隆进行质粒提取。对提取的质粒进行BamHI和EcoRI双酶切验证。琼脂糖凝胶电泳结果表明(图5),重组质粒经BamHI和EcoRI双酶切后显示有大小为2.2 kbp和4.8 kbp的两条特异性条带,与预测正确重组质粒的酶切结果基本一致。将酶切鉴定正确的质粒送上海生工测序,结果表明本实验成功构建了黄原胶裂解酶表达载体pGEX-xly。

图5 重组质粒pGEX-xly的BamHI和EcoRI双酶切验证电泳图Fig.5 The electrophoresis results of the recombinant plasmidpGEX-xly digested by BamHI and EcoRI注:泳道1为酶切条带;泳道M为DNA Marker。

将表达载体pGEX-xly转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,复苏1 h后,将菌液涂布在氨苄青霉素抗性平板,37 ℃静置培养24 h,挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示,直接以阳性菌落为模板扩增获得大小在2.2 kbp附近的特异性条带,这与黄原胶裂解酶截短基因片段理论大小基本一致,证明黄原胶裂解酶表达菌BL21-pGEX-xly构建成功。

图6 黄原胶裂解酶表达菌BL21-pGEX-xly的PCR鉴定Fig.6 PCR identification of xanthan lyaseexpressing strain BL21-pGEX-xly注:泳道1为阴性对照菌株;泳道2为BL21-pGEX-xly;泳道M为DNA Marker。

2.3 黄原胶裂解酶的异源表达及纯化

在前期工作中,尝试利用大肠杆菌pET表达系统进行黄原胶裂解酶的表达,其N端融合有His纯化标签。遗憾的是,利用该系统表达出的裂解酶绝大部分以包涵体的形式存在,说明该酶在大肠杆菌中表达时蛋白质正确折叠的效率较低。有文献报道,谷胱甘肽巯基转移酶亲和纯化标签(GST)能够有效地帮助融合的蛋白质正确折叠[22]。因此,为了提高蛋白质的可溶性表达水平,本实验利用载体pGEX-xly的构建在黄原胶裂解酶的N端融合了GST纯化标签,表达的融合蛋白命名为XLY-GST。

将黄原胶裂解酶表达菌BL21-pGEX-xly加入终浓度为0.5 μmol/L的IPTG于16 ℃诱导培养12 h。离心收集诱导菌体之后进行细胞破碎,获得含有黄原胶裂解酶的粗酶液。利用Glutathione Sepharose 4B亲和填料对XLY-GST进行纯化。SDS-PAGE电泳结果表明(图7),XLY-GST在大肠杆菌中能够高水平的可溶性表达。经过结合、洗涤、洗脱等一系列纯化步骤所获得的XLY-GST条带较为单一,杂蛋白被有效的去除。其中,目的蛋白XLY-GST分子质量约为104 ku(其中,GST大小为26 ku)。经Bradford法检测纯化的XLY-GST质量浓度为0.4 mg/mL,比酶活为 2.5 U/mg,目的蛋白质的回收率为11.8%,纯度大于90%。此外,未添加IPTG诱导剂的阴性对照细胞破碎上清液未见目的蛋白质表达条带,且未检测到黄原胶裂解酶酶活力(图中未显示),进一步证明图7中诱导表达的大小约为104 ku的蛋白质为黄原胶裂解酶。

图7 黄原胶裂解酶亲和纯化过程的SDS-PAGE电泳Fig.7 SDS-PAGE analysis of affinity purification steps of xanthan lyase注:泳道1为粗酶液;2为穿出液;3为清洗液;4为洗脱液;M为蛋白质Marker。

2.4 黄原胶裂解酶的酶学性质研究

如图8(A)所示,黄原胶裂解酶在反应温度为40～70 ℃时具有较高的相对酶活力,当酶反应温度降到35 ℃时,酶活力急剧下降,该酶的最适酶反应温度为40～45 ℃。对酶热稳定性考察结果图8(B)可以看出,该裂解酶在温育温度低于35 ℃时,能够保持稳定的酶活力,随着温度的升高,酶的稳定性下降。

图8 黄原胶裂解酶最适温度(A)及热稳定性(B)Fig.8 The temperature optimum(A) and thermostability(B)of xanthan lyase注:*代表该实验组酶活力与酶活力最高组相比有显著性差异(p≤0.05)。

随后,对黄原胶裂解酶的最适pH进行了考察。结果如图9(A)所示,黄原胶裂解酶在pH为6.0时表现出最大酶活力,但是随着酶反应pH的增大或减少,该酶的酶活力急剧下降。如图9(B)所示,当酶液在pH为5.5～10.5的缓冲液中温育2 h后,均能够保持稳定的酶活力,该结果说明黄原胶裂解酶对碱性环境具有一定的耐受能力。

图9 黄原胶裂解酶最适pH(A)及pH稳定性(B)Fig.9 The pH optimum(A)and pH stability(B)of xanthan lyase

随后,考察了不同金属离子的存在对黄原胶裂解酶活力的影响。如图10所示,当溶液中含有Ca2+和Mn2+时,黄原胶裂解酶的酶活力有较大幅度提高,分别增加了8.8倍和9.7倍,溶液中Cu2+则对黄原胶裂解酶有一定的抑制作用。而其他金属离子的加入,均对酶活力没有较大的影响。

图10 不同金属离子对黄原胶裂解酶活力的影响Fig.10 Influence of metal ions on xanthan lyase activity注:*代表实验组酶活力与对照组酶活力相比有显著性差异(p≤0.05)。

为了考察黄原胶侧链中的乙酰基及丙酮酸基修饰对裂解酶活力的影响,对黄原胶底物进行了去乙酰基和去丙酮酸基团的处理。从表1中可知,未处理的黄原胶乙酰基和丙酮酸基的含量分别为29%和52.9%,去乙酰基反应可以有效地完全去除黄原胶侧链的乙酰基团,而去丙酮酸基实验只能部分去除黄原胶侧链的丙酮酸基团。不同侧链化学修饰的黄原胶与黄原胶裂解酶反应结果表明,黄原胶侧链的乙酰基团和丙酮酸基团分别被去除时均能导致黄原胶裂解酶活力下降,分别为对照酶活力的68%和60%。当两种化学基团同时被去除时,黄原胶裂解酶活力有较大程度下降,为对照酶活力的44%。该结果说明黄原胶侧链的化学修饰程度对黄原胶裂解酶的活性有明显的影响。

表1 不同黄原胶底物对黄原胶裂解酶活力的影响Table 1 Influence of the various xanthan on activities of xanthan lyase

3 结论

以一株性能优良的黄原胶降解菌Microbacteriumsp. XT11为出发菌株[11],从中克隆出3546 bp黄原胶裂解酶编码基因。将去掉分泌信号肽及CBM的截短裂解酶的N端融合GST亲和纯化标签,在大肠杆菌中进行了异源表达,发现其可溶性表达水平较之前文献报道有显著提高,纯化回收率达11.8%。纯化的黄原胶裂解酶-GST融合蛋白表现出与天然黄原胶裂解酶一致的酶学性质[13],其最适作用温度为40～45 ℃,最适pH为6.0,对高温的耐受力较低,对碱性环境具有一定的耐受力。Ca2+和Mn2+对该裂解酶有显著地激活作用,而Cu2+则对该酶有一定的抑制作用。黄原胶侧链的化学修饰对裂解酶的活力也有较大影响,当侧链乙酰基及丙酮酸基团被去除,裂解酶酶活有显著降低。

本实验所取得的研究结果为今后黄原胶裂解酶进一步性质表征、酶液大量制备及黄原胶侧链修饰研究奠定了基础。

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Heterologous expression and characterization of a novel xanthan lyase

DU Yuan-yuan,GUO Xiao-yu,LI He,WANG Ya-fang,YANG Fan*,LI Xian-zhen

(School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic Unversity,Dalian 116034,China)

Xanthan lyase is a kind of xanthan-modifying enzymes which are powerful tools for xanthan modification and xantho-oligosaccharide preparation. In this paper,a novel xanthan lyase-encoding genexlywas cloned and sequenced for the first time,from an excellent xanthan-degrading strainMicrobacteriumsp. XT11. Thexlygene encoded a 122027 u protein,including a 35-amino acid signal peptide at N terminus and a 392-amino acid carbohydrate binding module(CBM)at C terminus. A mature enzyme without signal peptide and CBM was fused with a GST tag and the resulted XLY-GST could be expressed inEscherichiacoliBL21(DE3)in a high level. The purified XLY-GST showed similar features with that of the wild type xanthan lyase. It was optimally active at pH6.0 and 40 ℃ and alkali-tolerant at a high pH value of 10.5. The metal ions including Ca2+and Mn2+strongly stimulated xanthan lyase activity but ion Cu2+was its inhibitor. XLY-GST was specific on the pyruvated and mannosyl residue in the intact xanthan molecule. Our work should be valuable for preparing the xanthan lyase and studying the modification of xanthan side chain.

xanthan lyase;xanthan modification;enzyme characterization

2016-07-18

杜元元(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：分子微生物学，E-mail:13795153774@163.com。

*通讯作者:杨帆(1982-)，女，博士，副教授，研究方向：多糖生物降解分子机理，E-mail：yang_fan@dlpu.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31371742,31601458)；辽宁省高等学校杰出青年学者成长计划(LJQ2015009)；大连市科技计划(2013B11NC078)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0175-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.025