冷等离子体技术对黄瓜表面大肠杆菌O157∶H7生物膜的清除作用研究

崔海英,柏 梅,戴锦铭,陶贵泽,林 琳

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

冷等离子体技术对黄瓜表面大肠杆菌O157∶H7生物膜的清除作用研究

崔海英,柏 梅,戴锦铭,陶贵泽,林 琳*

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

利用冷源氮气等离子体杀菌技术清除新鲜黄瓜表面的大肠杆菌O157∶H7生物膜。试管实验结果表明,等离子体对大肠杆菌O157∶H7生物膜有较好的清除作用,在作用功率为500 W,连续作用4 min后对生物膜清除率达到99.99%。当等离子体应用于黄瓜表面时,作用4 min时,杀菌率达到99.21%。激光共聚焦显微镜结果显示:等离子体作用后,菌落数量和细菌生物膜厚度明显小于对照组。场发射扫描电子显微镜结果显示:与对照组比较,等离子组4 min处理后细菌群落附着数量显著变少。总之,等离子体技术在基本维持食品感官的前提下提高了新鲜黄瓜的微生物安全性。

冷等离子体,大肠杆菌O157∶H7,生物膜,黄瓜,杀菌作用

细菌生物膜是指附着于惰性或者活性实体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体[1]。极具危害的是,细菌可在食品表面形成生物膜,包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、大肠杆菌等。在食源性致病菌中,大肠杆菌O157∶H7是最危险的一种,它的感染剂量非常低,极易引起胃肠疾病的爆发,而其24 h便可形成成熟的生物膜。大肠杆菌O157∶H7能够污染各种食品,其中新鲜蔬菜污染的频率非常高[2]。2011年德国出现了受出血性大肠杆菌污染的“毒黄瓜”事件,致多人死亡。随后,“毒黄瓜”在欧洲蔓延,并造成多国千人以上的大型食源性感染事故。研究发现大肠杆菌O157∶H7经常会聚集在植物叶子的气孔、被损伤处形成生物膜[3]。生物膜一旦形成即具有较强的黏附力,很难清除。

目前冷等离子体技术作为一种新兴的广谱灭菌技术,因其高效无害,操作简单,成本低廉而被广泛关注[4]。此外,等离子体技术作为一种物理杀菌方法可有效地避免化学消毒剂在食品中的残留,消除其不利影响,在有效杀灭细菌的同时维持产品的鲜味、风味和营养成分。我国已有研究利用等离子体技术来杀灭食源性致病菌[5-6],而关于等离子体对细菌生物膜的清除作用的相关研究甚少。一般的蔬菜清洗剂很难穿透生物膜的胞外脂多糖基质层,因此探索安全无毒的杀菌技术来清除生物膜是目前食品安全领域研究的前沿和热点。本文以研究清除黄瓜表面大肠杆菌O157∶H7生物膜为目的,探明等离子体是否能应用在新鲜蔬菜表面,维持微生物安全性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌O157∶H7(EscherichiacoliEHEC O157∶H7 CICC 21530,E. coli O157∶H7) 中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供;胰酪大豆胨液体培养基(Trypticase soy broth medium,TSB) 杭州微生物试剂有限公司;普通营养琼脂培养基(Nutrient Agar,NA) 蛋白胨10 g,牛肉膏5 g,氯化钠5 g,琼脂20 g,蒸馏水1000 mL;3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)试剂盒、4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)荧光染料 碧云天生物技术研究所。

APLM-SP-YB-D1KW-3232328-2-5冷源氮气等离子体装置 南京爱特维电子科技有限公司;Infinite 200 PRO全波长酶标仪 奥地利Tecan Austria GmbH Untersbergstr公司;TCS SPS Ⅱ激光共聚焦显微镜 德国 Leica 公司;JSM-7001F场发射扫描电子显微镜 日本JEOL公司;Color Quest XE分光测色仪 美国HunterLab公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT染色法确定等离子体对大肠杆菌O157∶H7生物膜的清除作用 将400 μL无菌TSB加到48孔板中,接入大肠杆菌O157∶H7(105～106CFU/mL)。将其置于25 ℃恒温培养箱中静置培养,培养1 d后轻轻吸除孔中上部的培养基及悬浮细菌,用无菌磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS,0.03 mol/L,pH7.2)轻轻清洗三次,更换新的TSB。此步骤每天重复一次,培养5 d,使得孔板底部和周围形成较多的生物膜。成熟的生物膜获得后,用PBS冲洗掉未完全附着的细菌。将48孔板置于冷等离子体载物台上,打开电源调节氮气流量为100 sccm,产生辉光处理样品。首先控制时间为最大限度的4 min,通过改变频率或电流来调节等离子体的强度,不同功率(0、300、400、500、600 W)处理样品确定合适的作用功率。确定合适功率后,不同时间(0、0.5、1、2、4 min)处理样品,确定合适作用时间。处理后在孔板中加入400 μL MTT(0.5 mg/mL),37 ℃静置培养4 h后,加入100 μL细胞裂解液,继续静置培养至紫色结晶溶解。用酶标仪测定样品在570 nm处的吸光值。本实验重复三次[7]。

1.2.2 菌落计数法测定等离子体对大肠杆菌O157∶H7生物膜的清除作用 不锈钢片(2 cm×2 cm)浸泡在无水乙醇中超声清洗4 h,用蒸馏水清洗干净后,121 ℃灭菌15 min。将无菌不锈钢片加入接有大肠杆菌O157∶H7(105～106CFU/mL)的TSB培养基中,25 ℃静置培养5 d,期间每天更换一次新鲜TSB。5 d后将不锈钢片取出,用无菌0.03 mol/L PBS清洗三次,放入无菌培养皿中。随后用等离子体按照上述步骤处理样品以确定合适作用功率和时间，未经等离子体处理样品作为空白。处理后将不锈钢片放入含有10 mL PBS的离心管中,低功率下超声10 min,使生物膜分离形成单个浮游细菌的形式。将以上得到的菌悬液十倍梯度稀释,涂布于NA琼脂培养基测定残存活菌数。每个测定重复三次取平均值[8]。

杀菌率或清除率(%)=(空白组菌数-实验组残存菌数)/空白组菌数×100

1.2.3 激光共聚焦显微镜观察生物膜 将盖玻片用无水乙醇浸泡,超声清洗4 h,用蒸馏水清洗干净后,121 ℃灭菌15 min。将无菌盖玻片加入无菌TSB中并接入大肠杆菌O157∶H7(105～106CFU/mL),25 ℃静置培养5 d,去除游离细菌后,用等离子体处理。将盖玻片放入DAPI溶剂中避光染色15 min,随后用激光共聚焦显微镜观察生物膜。不加处理的盖玻片作为空白对照[8]。

1.2.4 场发射扫描电镜观察生物膜 参照上述步骤,将大肠杆菌O157∶H7生物膜培养在无菌尼龙片(1 cm×1 cm)上。将尼龙片用无菌PBS清洗三次后在超净工作台内稍晾干,随后用冷等离子体处理,借助场发射扫描电子显微镜观察生物膜变化情况[3]。

1.2.5 等离子体对黄瓜表面大肠杆菌O157∶H7生物膜的清除作用 将黄瓜皮切片,约为1 cm×1 cm,浸泡在100 ppm次氯酸钠溶液中,超声清洗1 h,随后置于紫外灯下辐射处理以除去黄瓜表面原始微生物。将黄瓜片置于含有105～106CFU/mL大肠杆菌O157∶H7的TSB中,25 ℃静置培养3 d。取出黄瓜片经无菌PBS多次充分漂洗去掉浮游菌,随后控制等离子体功率为500 W,以不同时间(0、1、2、3、4 min)处理黄瓜样品。随后取相同处理的黄瓜片10片,置于100 mL PBS中用均质器均质,混匀菌液后,按照平板菌落计数法进行活菌计数[9]。

1.2.6 质量与感官评价分析 将新鲜黄瓜切块,取相同部位由等离子体500 W处理4 min后用分光测色仪分析表面颜色变化,获得L*(lightness,亮度指数,与颜色浓淡相关,L*值越大颜色越淡),a*(redness,正值越大红光越强,负值越大绿光越强)和b*(yellowness正值越大黄光越强,负值越大蓝光越强)值。最后在江苏大学食品学院选择20名同学对黄瓜的感官性能以打分的形式做出评价,由1～9分代表着“非常不喜欢”至“非常喜欢”[10]。

1.2.7 数据处理 所有实验一式三份,取其平均值。使用SPSS软件(Windows 22.0版本)进行统计分析。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析空白组与各实验组之间的显著性差异,p<0.05表明有显著性差异。误差线对应于三组重复实验的标准偏差。

2 结果与分析

2.1 不同功率等离子体对大肠杆菌O157∶H7生物膜的清除作用分析

实验通过测定生物膜的代谢活性以及残存活菌的数量来评价等离子体的清除生物膜性能。如图1所示,随着处理功率的增加,实验组的吸光值明显降低,当处理功率为500 W和600 W时,吸光度值差别不大,所以选择以500 W的处理功率做不同时间的实验。而残存菌数法与MTT法的实验结果具有很好的相关性。未被等离子体作用的不锈钢片上生物膜活菌数为107～108CFU/cm2,经过等离子体作用后细菌数量不断减少。

图1 等离子体不同处理功率对大肠杆菌O157∶H7生物膜活性的影响Fig.1 Effect of different treatment power of plasma on the viability of E. coli O157∶H7 biofilms注:*表示与空白组有显著性差异;图2同。

2.2 不同时间等离子体对大肠杆菌O157∶H7生物膜的清除作用分析

如图2所示,经过等离子体作用后,吸光度值显著降低,随着处理时间的延长,其对大肠杆菌O157∶H7代谢活力的抑制作用逐渐增强。这可能是由于等离子体的活性成分作用于细菌,使其细胞膜通透性增加,大量离子、核酸及蛋白等物质发生泄漏,细胞代谢紊乱,从而使其代谢活力受到了抑制。根据残存菌数图可以得出，等离子体在作用功率为500 W时,连续作用4 min时对不锈钢片上的生物膜清除率达到99.99%。实验结果表明等离子体能有效清除48孔板及不锈钢片上的大肠杆菌O157∶H7生物膜。

图2 等离子体不同处理时间对大肠杆菌O157∶H7生物膜活性的影响Fig.2 Effect of different treatment time of plasma on the viability of E. coli O157∶H7 biofilms

2.3 激光共聚焦显微镜观察生物膜

采用激光共聚焦显微镜,直观地观察了大肠杆菌O157∶H7生物膜在等离子体处理前后的形态变化。如图3所示,由未经等离子体处理(空白组)至处理时间的延长,荧光强度明显地逐渐减弱。空白对照组中大量的大肠杆菌O157∶H7相互聚集粘连,层层堆集,形成一层致密的膜结构。经过等离子体作用后,可清晰地看到大部分生物膜结构被破坏;作用时间越长,细菌生物膜的结构遭到的破坏越大;作用1 min时,生物膜厚薄不均,结构稀疏,但仍有大量的细菌连成片呈云雾状;作用长达4 min时,仅剩余少量细菌粘附于盖玻片表面。实验结果表明,等离子体对大肠杆菌O157∶H7生物膜有良好的清除效果。

图3 激光共聚焦显微镜下各实验组的生物膜形态(2000×)Fig.3 Confocal laser scanning microscope images of E. coli O157∶H7 biofilm after different treatment(2000×)注:a. 空白组;b. 等离子体处理1 min;c. 等离子体处理2 min;d. 等离子体处理4 min。

2.4 场发射扫描电镜观察生物膜

图4 场发射扫描电镜下生物膜形态Fig.4 SEM images of E. coli O157∶H7biofilm after different treatment注:a. 空白组;b. 等离子体处理4 min。

场发射扫描电镜更加细微地观察了等离子体对大肠杆菌O157∶H7生物膜的失活作用。如图4所示,空白组中大肠杆菌O157∶H7聚集粘附在尼龙片表面,形成一层厚厚的紧密的生物膜结构,且能观察到细菌分泌的丝状多糖存在。经等离子体处理后,完整的生物膜结构被破坏,细菌分散,剩余的少量浮游细菌聚集成较小的团状,且细菌表面形态坍塌、不光滑,内容物渗出后菌体干瘪、失活。

2.5 等离子体对黄瓜表面大肠杆菌O157∶H7生物膜的清除作用

结果显示,等离子体可有效地清除黄瓜表面的大肠杆菌 O157∶H7生物膜。与对照组相比,500 W处理4 min后,等离子体杀菌率达到了99.21%。当等离子体杀菌技术应用于黄瓜表面时,仍可以达到较好的杀菌效果,但与试管实验相比较差,这是由于处理对象表面粗糙度的差异使得杀菌效果不同[11],黄瓜表面粗糙的特点降低了等离子体的杀菌作用。

图5 等离子体(500 W)不同处理时间对黄瓜表面大肠杆菌O157∶H7生物膜活性的影响Fig.5 Effect of different treatment time(power:500 W)of plasma on the viability of E. coli O157∶H7biofilms formed on cucumber surface注:*表示与空白组有显著性差异。

2.6 质量与感官评价分析

等离子体(500 W)处理黄瓜4 min后,表面色差实验各项指标以及感官指标的变化情况见表1,在等离子体处理后,亮度L*值降低,a*值变大,b*值变大,表明等离子体处理使得黄瓜表面色泽不如新鲜黄瓜。感官得分可知,外观、颜色、味道及总体接受性分数相比对照组都略有下降。综合上述结果,等离子体对黄瓜的品质略有影响,但总体上可被大家接受。

表1 冷等离子体对黄瓜感官质量的影响Table 1 Effect of cold plasma on sensory quality of cucumber immediately after treatment

3 结论

等离子体对大肠杆菌O157∶H7生物膜有较好的清除作用,在作用功率为500 W,连续作用4 min后对生物膜清除率达到99.99%。当其应用于黄瓜表面时,作用4 min 后,杀菌率达到99.21%。结果表明等离子体对生物膜有较好的杀灭效果。本实验还借助于激光共聚焦显微镜、环境扫描电子显微镜直接观察了等离子体对生物膜的清除情况。以上实验更直观地表示了等离子体具有较好的抗生物膜性能。随后的感官评价表明等离子体在杀灭细菌生物膜时对新鲜黄瓜的颜色、质地、及口感影响甚小。

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Antimicrobial activity of cold nitrogen plasma againstEscherichiacoliO157∶H7 biofilms on cucumber

CUI Hai-ying,BAI Mei,DAI Jin-ming,TAO Gui-ze,LIN Lin*

(School of Food & Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

This study focuses on the bactericidal effect of cold nitrogen plasma onEscherichiacoliO157∶H7(E.coliO157∶H7)biofilms formed on fresh cucumber. The results of the vitro experiment demonstrated that plasma has a satisfactory eradicating effect onE.coliO157∶H7. After exposure to plasma at 500 W for 4 min,almost 99.99% and 99.21% reductions inE.coliO157∶H7 populations were achievedinvitroand on cucumber,respectively. Confocal laser scanning microscopy(CLSM)was adopted to detect the bacterium community quantity unit area and thickness of bacterium biofilms. Scanning electron microscope(SEM)was used to observe surface structure of biofilms. In conclusion,plasma was an effective method on eradicating biofilms and simultaneously had mild effect on sensory quality of fresh cucumber.

cold nitrogen plasma;EscherichiacoliO157∶H7;biofilms;cucumber;antibacterial effect

2016-07-18

崔海英(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail:cuihaiying@ujs.edu.cn。

*通讯作者:林琳(1978-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物，E-mail:linl@ujs.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31301573)；江苏省自然科学基金项目(BK20130493);江苏大学第十五批大学生科研立项(15A168);江苏省第十三批“六大人才高峰”高层次人才项目(NY-013)。

TS255

A

1002-0306(2017)02-0162-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.022