以阿魏酸为底物微生物转化生产香兰素的研究进展

樊永华

永城职业学院 (永城 476600)

以阿魏酸为底物微生物转化生产香兰素的研究进展

樊永华

永城职业学院 (永城 476600)

本文从枯草芽孢杆菌、拟无枝酸菌属放线菌、恶臭假单胞菌、盐单孢菌、链霉菌、朱红密孔菌、黑曲霉和朱红密孔菌两步生物转化、桑肠杆菌、大肠杆菌等微生物方面阐述了以阿魏酸为底物，利用微生物转化生产天然香兰素的研究进展。

阿魏酸；微生物转化；香兰素

香兰素的化学名称为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，又名甲基原儿茶醛、香草醛。香兰素用途非常广泛，被应用于食品、酿酒、医药、日用化工、农业、橡胶、塑料、烟草等多个行业。香兰素是使用最多的食品赋香剂之一，有“食品香料之王”的美誉，可配制多种食用香精。

香兰素主要有3种制备方法，一是从天然植物如香荚兰豆中提取，但其提取方法价格贵，产量低；二是以工业纸浆废液和石油化学品为原料用化学方法合成，而化学合成法的香兰素香型单一、容易造成环境的污染，不符合人们对于天然食品和天然原料追求的趋势；三是以丁香酚、阿魏酸等为底物进行生物转化[1-3]。据报道阿魏酸、丁香酚都能经香兰素而被降解。但与丁香酚相比较，阿魏酸是最丰富的酚类化合物之一，它广泛存在于木质纤维素、植物细胞壁和小麦、玉米等农作物的细胞壁上，并且阿魏酸对微生物的毒性作用小，不失为一种较好的底物[4-5]。以阿魏酸为底物利用枯草芽孢杆菌、拟无枝酸菌属放线菌等微生物进行生物转化生产香兰素工艺简便，收率高，能耗低，污染小，产品安全可靠。用微生物发酵法合成香兰素，并广泛应用于工业生产中，是今后发展的趋势。

1 枯草芽孢杆菌B7-S

Chen等[6]筛选出的利用阿魏酸能够生物转化形成香兰素的枯草芽孢杆菌菌株B7-S是一种有氧的，形成内生孢子的革兰氏阳性菌。Chen等进行了利用枯草芽孢杆菌B7-S以阿魏酸为底物生物转化香兰素的研究，结果表明利用枯草芽孢杆菌生产香兰素的最佳生物转化条件为：温度35 ℃、初始pH 9、接种量5%、阿魏酸浓度0.6 g/L、培养基体积20%、振荡速度200 r/min。在这些条件下，反复多次的小规模实验表明，最大转换效率为63.30%，3 h后转化。香兰素产品通过从紫外-可见，电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)光谱数据获得证实。扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)结果证实，枯草芽孢杆菌的细胞表面在阿魏酸的耐受性诱导中起着重要作用。这些结果表明，利用枯草芽孢杆菌B7-S以阿魏酸为底物生物转化香兰素具有很大的潜力。

2 拟无枝酸菌属放线菌39116

Christian Fleige等[7]利用美国菌种保藏中心(ATCC)保藏的革兰氏阳性菌拟无枝酸菌属ATCC 39116以阿魏酸发酵生产香兰素。该菌株对香兰素具有超强的耐受性。为了提高发酵过程的生产率，将菌株代谢设计在较高的终浓度和摩尔产量阶段。通过编码中央香兰素代谢酶香兰素脱氢酶基因(vdh)的缺失可降解香兰素达90%以上。这种突变提高了香兰素的最终浓度，最终浓度超过2.2 g/L，摩尔产量80.9%。进一步的改进可以通过香兰素合成基因ech和fcs的组成型表达来实现。ech和fcs分别是编码烯酰辅酶A/醛缩酶和阿魏酰辅酶A合成酶的基因。这两个基因的转录被证明是阿魏酸诱导的。它解释了在野生型细胞有效生产香兰素之前的发酵过程中的不必要的适应阶段。通过消除这两个基因的构建和增强表达的适应阶段，最后可得到香兰素的浓度为19.3 g/L和94.9%的摩尔收率。此外，使用改进的进料策略，以较低的摩尔产率为代价，会获得甚至更高的香兰素浓度，浓度可达22.3 g/L，这是有史以来除了提取产品外，在微生物发酵过程达到的最高的香兰素浓度。香兰素的摩尔产率几乎接近其理论的最大值。

3 恶臭假单胞菌KT2440

Nadja Graf等[8]以被遗传优化的非致病菌恶臭假单胞菌菌株KT2440将阿魏酸转化为香兰素。香兰素脱氢酶基因(vdh)的缺失不能充分防止香兰素降解。通过转座子突变确认一个钼酸盐转运蛋白的额外失活会导致其作为唯一碳源无法在香兰素上生长。通过采用强大的tac启动子系统增强阿魏酸辅酶A合成酶基因(fcs)和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因(ech)的结构基因的染色体表达来优化转化。进一步的遗传工程导致较高的初始转换率和香兰素摩尔产量高达86%，在短短3 h伴有副产物水平很低。据我们所知，迄今为止，这是代表获得摩尔香兰素最高的生产率和产量的一种假单胞菌菌株。加上其对阿魏酸的高耐受性，发达，无质粒的恶臭假单胞菌菌株是生物技术生产香兰素很有发展前途的候选菌株。

4 盐单孢菌株B15

Ioannis Vyrides等[9]从拉纳卡盐湖细菌中筛选以阿魏酸为底物生产香兰素和香草酸的菌株。他们从50个生长在1 g/L阿魏酸的耐热/嗜盐菌中筛选出盐单孢菌株B15。他们采用静息细胞法来提高阿魏酸转化香草酸和香草醛的能力。在该方法中，使用分离的盐单胞菌B15(生物量5 g/L)在1.5 g/L阿魏酸和盐浓度分别为0、50、100、200 g NaCl/ L进行了测试。112 h后仅在0 g NaCl/ L而产生香草酸(390 mg/L)，在50和100 g/L NaCl产生香草酸200 mg / L，200 g / L的NaCl没有香草酸的产生。因此，盐单胞菌B15使用静息细胞法(5 g/ L)在较低的阿魏酸初始浓度(1.2 g/L和0.5 g/L不含盐)进一步测试。在48 h后1.2 g/L阿魏酸生物转化香草酸271 mg/L。在此条件下，120 h生成香兰素74 mg/L，阿魏酸逐渐消耗。48 h后0.5 g/L阿魏酸获得香兰素的最高产量(245 mg/L)，转化率为49%，之后逐渐下降。48 h香草酸(112 mg/L)和香兰素均达到最大值。盐单胞菌sp.B15产生高产量的香兰素，只有在0.5 g/L阿魏酸，而不是1.2 g/L阿魏酸，可能是由于高浓度的香兰素对细胞产生毒性的原因[9-10]。

目前的研究表明，盐单胞菌在低盐度下以0.5 g/L阿魏酸为底物能够产生香兰素。B15菌株是首次报道的盐单胞菌属中在无盐条件下能够从阿魏酸生物转化高产量香兰素的菌株。将来通过优化工程或基因改良盐单胞菌B15可以更好地提高香兰素的产量。

5 链霉菌L1936

董长颖等[4]采用实验室保藏的菌种链霉菌L1936在37 ℃、190 r/min条件下能将阿魏酸大量转化为香兰素，摩尔转化率高达42.97%。阿魏酸和香兰素对菌体的生长具有一定的毒性作用，但链霉菌L1936不仅能耐受其毒性，而且还能利用阿魏酸和香兰素作为其生长的唯一碳源，将阿魏酸转化为香兰素。当添加阿魏酸的浓度较低时，链霉菌L1936积累的是香草酸和香兰素，但当阿魏酸添加的浓度较高时，香兰素作为链霉菌L1936的过量合成产物被大量积累。链霉菌L1936能够将6 g/L阿魏酸转化为2.02 g/L香兰素，表现出明显异于其它菌株的代谢流。连续流加两次阿魏酸底物后，香兰素的浓度可达4.38 g/L，相应的摩尔转化率高达为44.58%。

6 朱红密孔菌

朱红密孔菌属于白腐真菌，利用其将阿魏酸生物转化成天然香兰素的过程可分为菌体的生长和转化两个阶段。生长阶段的目的是获得最大量的能够有效转化香草酸能力的菌体。当加入底物香草酸后即进入转化阶段。种子培养基是供菌体繁殖和生长的，有效的碳源和氮源能促进菌体的快速生长。发酵培养基更要从利于菌体的生长繁殖，又要获得大量的产物，培养基组成完全、丰富，也不能营养过剩等各方面综合考虑[11-12]。张莉力等[12]以碱解麦麸获得的阿魏酸为发酵底物，利用朱红密孔菌产生天然香兰素。他们主要研究如何优化种子培养基和发酵培养基以获得香兰素的最大摩尔转化率。研究结果优化选择了果糖(50 g/L)、酵母粉(5 g/L)作为种子培养基的碳源和氮源。3 d的培养后，朱红密孔菌的生物量较初始培养基提高了约0.5 g/L。在高密度培养基中培养3 d后的朱红密孔菌接种于由阿魏酸溶液(0.5 g/L)配制的发酵液中，并每隔24h添加4次阿魏酸浓缩液(5 g/L)。他们对发酵培养基进行优化选择试验。试验表明，优化的发酵培养基配方为：20 g/L的果糖作为碳源，3 g/L的酵母粉作为氮源，无机盐为0.2 g/L的磷酸二氢钾，0.013 2 g/L的氯化钙，0.5 g/L的硫酸镁。发酵培养9 d，香兰素的浓度达到最高值(0.403 g/L)，相应的摩尔转化率为28.8%。

7 黑曲霉和朱红密孔菌两步串联

郑璞等[11]以米糠中提取的天然阿魏酸为发酵底物，采取两步串联微生物转化的方法制备香兰素。即先将黑曲霉CGMCC0774培养生长48 h后，加入底物阿魏酸，将阿魏酸生物转化成香草酸。当香草酸产量最大时，放罐，发酵液过滤除菌。然后将朱红密孔菌培养48h后，加入处理后的发酵液，35 ℃下，将香草酸转化成香草醛，香草醛产量最大时，放罐。最后得到香兰素的浓度达到1.1 g/L(质量浓度)，对阿魏酸的摩尔转化率为34.01%。朱红密孔菌自身能够代谢阿魏酸生成香兰素和香草酸，但也会代谢阿魏酸生成二聚体等其它途径，使得发酵液成分复杂，不利于提取香兰素[13]。先采用黑曲霉将阿魏酸转化为香草酸，可以减少发酵液中的成分，再采用朱红密孔菌转化香草酸，利于香兰素的提取和产量的提高。

8 桑肠杆菌VL4-3

喻林等[14]首次发现桑肠杆菌VL4-3能将阿魏酸生物转化成香兰素，桑肠杆菌VL4-3是从香荚兰茎中筛选得到的菌株。他们以阿魏酸为发酵原料，研究桑肠杆菌VL4-3生物转化生产香兰素的发酵工艺。通过对单因素研究发酵培养基的碳源、氮源和无机盐离子对香兰素产量的影响，以及选取最佳碳源(麸皮)、最佳氮源(豆粕)和最佳无机盐(硫酸亚铁)相对含量的确定L9(34)正交表进行正交试验，还选取了单因素研究发酵培养条件(发酵培养初始pH值、温度、接种量、阿魏酸添加量和阿魏酸添加时间、摇瓶装液量和转速、发酵过程光照/避光)对香兰素产量的影响，以及，选取L9(34)正交表，考察菌种接种量、底物添加量和底物添加时间对香兰素产量的影响。单因素研究了种子培养基和培养条件(种子液的培养温度、种子培养基、种子液的转速)对香兰素产量的影响，还研究了底物添加量对香兰素产量的影响。最后经过优化验证确定，发酵培养基的组成为：最佳氮源豆粕(1 g/L)，最佳碳源麸皮(10 g/L)，氯化钠0.5 g/L，无机盐硫酸亚铁(0.5 g/L)，pH(8.0)；种子液培养基组成为蛋白胨10 g/L，麦芽糖50 g/L，氯化钠5 g/L，25 ℃、100 r/min培养24 h。将10%的VL4-3种子液接种于容器装液量为10%的发酵培养基中，24 h培养后，加入10 g/L的阿魏酸，37 ℃、100 r/min转速避光培养12 d，最后得到发酵液中的香兰素浓度达到2 262.43 mg/L，相应的转化率达到28.87%。

9 大肠杆菌

Toshiki等[15]研究表明可以使用独立辅酶脱羧酶Fdc和加氧酶CsO2通过4-乙烯基愈创木酚从阿魏酸中生产香兰素。在研究中，他们研究了一项用大肠杆菌在第一阶段表达Fdc和在第二阶段表达CsO2的全细胞催化剂生产香兰素的新两罐生物工艺。他们首先优化了决定生产香兰素速率的第二步CsO2反应，即4-乙烯基愈创木酚转化为香兰素步骤。添加了FeCL2的培养基增强了大肠杆菌细胞表达CsO2的活性，是一种属于类胡萝卜素裂解酶的铁蛋白。此外，乙酸丁酯—水两相系统可有效提高香兰素的产量。在优化的条件下，他们试图采用摇瓶两罐生物工艺从阿魏酸生产香兰素。在第一阶段中，大肠杆菌迅速表达Fdc将阿魏酸脱羧和在pH 9.0条件下2 h内75 mm的底物完全转化为4-乙烯基愈创木酚。第一阶段反应后，细胞通过离心从反应混合物中除去，而得到的上清液的pH调整到10.5，对于CsO2是最佳pH值。然后进行第二阶段反应。在第二阶段，大肠杆菌有效表达CsO2将4-乙烯基愈创木酚氧化为香兰素。香兰素的浓度在24 h内达到52 mm(7.8 g/L)，这是迄今为止采用重组细胞的生物技术生产香兰素的最高水平。

10 结语

香兰素和相关代谢产物因为价格相对较低和天然越来越受欢迎，具有较好的经济价值。然而,香兰素的生产过程不环保和底物缺乏选择性。此外，根据欧洲立法(指令88/388/EEC)，这将限制使用化学合成的香兰素在食品、饮料和化妆品中。天然香兰素在世界市场上很受欢迎，但它价格很高，通过从香荚兰直接提取天然香兰素有许多问题，提取浓度低，使提取过程昂贵[16-17]。通过微生物生产天然香料是一个有前途的新兴领域。利用微生物可以将低廉的物质如阿魏酸生物转化为高附加值产品如香兰素，这是非常经济的一条途径[18]。

单纯的微生物转化香兰素的效率比较低，朱红密孔菌为28.8%，桑肠杆菌VL4-3为28.87%，链霉菌L1936为44.58%，盐单孢菌株B15为49%，枯草芽孢杆菌B7-S 63.30%。两种微生物结合转化香兰素的摩尔转化率为34.01%，产量也不是很高。但是将遗传基因工程引入后，香兰素的转化率大大提高，拟无枝酸菌属放线菌39116通过编码中央香兰素代谢酶香兰素脱氢酶基因(vdh)的缺失摩尔产量达到80.9%。通过消除烯酰辅酶A/醛缩酶基因(Ech)和阿魏酰辅酶A合成酶基因(Fcs)这两个基因的构建和增强表达的适应阶段，最后可得到香兰素的浓度为19.3 g/L和94.9%的摩尔收率。恶臭假单胞菌KT2440通过采用强大的tac启动子系统增强阿魏酸辅酶A合成酶基因(fcs)和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因(ech)的结构基因的染色体表达来优化转化。进一步的遗传工程导致较高的初始转换率和香兰素摩尔产量高达86%。由此可见，将遗传基因工程引入微生物转化生产香兰素，具有更大的发展潜力。

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Researchprogressontheproductionofvanillinbymicrobialtransformationsubstratefromferulicacid

Fan Yonghua

Yongcheng Vocational College (Yongcheng 476600)

The research progress on the production of vanillin by microbial transformation substrate from ferulic acid was described from the aspects of bacillus subtilis, amycolatopsis genus actinomyces, pseudomonas putida, halomonas, pycnoporus cinnabarinus, two-step bioconversion of aspergillus and pycnoporus cinnabarinus, mulberry enterobacter, escherichia coli and other organisms.

ferulic acid; microbial transformation; vanillin

2017-01-03

樊永华，女，硕士研究生，副教授，主要从事食品营养与检测、食品加工方面的教学和科研工作。

TS201

A

1672-5026(2017)06-043-05