中度海拔地区汉族人群男性不育患者精子中Chk1基因的表达变化及机制

张树娜，李燕子，杨惠林，黄文军，腾小娜

(青海红十字医院，西宁 810000)

以往国内外研究提示长期处于高原低氧环境下，男性精液质量呈下降趋势[1-3]。目前高原低氧环境导致精子浓度降低的机制尚无统一定论。

国外研究[4]发现，精子DNA损伤与精子活力呈负相关性，这提示精子DNA受损是影响男性精液质量因素之一。长期暴露在高原低氧环境下，精子DNA的损伤程度呈加重趋势[5]。细胞周期检测点激酶1(Checkpoint kinase1，Chk1)是细胞周期检测点的转导因子，在DNA损伤引起的周期检测点调节中发挥重要的作用。研究者[6]发现，Chk1表达的下降或失活会影响细胞损伤的修复。西宁地区汉族人群男性不育患者精子中Chk1基因表达情况不明。本研究通过检测正常精子组、少精子组、弱精子组、少弱精子组Chk1基因表达差异，首次探讨中度海拔地区高原低氧环境影响男性精液质量是否与Chk1表达变化有关。

1 材料与方法

1.1 精液标本收集

选择在青海红十字医院生殖中心因不育就诊的世居西宁地区(海拔2250m)汉族男性患者。按《WHO人类精液检查与处理实验室手册》(2010年，第5版)标准[7]，依就诊者精液检查结果分为正常精子组、少精子组、弱精子组和少弱精子组，每组收集标本20份。世界卫生组织依据精子运动能力，将精子活力分为前向运动(Progressive motility，PR)、非前向运动(Non-progressive motility，NP)、不活动(Immotility，IM)三级。精子密度≥15×106/mL，PR≥32%时为正常精子组；精子密度<15×106/mL，PR≥32%时为少精子组；精子密度≥15×106/mL，PR<32%时为弱精子组；精子密度<15×106/mL，PR<32%时为少弱精子组。行精液检查前就诊者需禁欲2～7天，采用手淫取精法，将精液留取至无毒、无菌的取精杯中，然后放置于37 ℃水浴箱内，液化后(15～40分钟)检测pH值。

1.2 主要试剂和仪器选择

ABI-7500型实时检测扩增仪(美国ABI公司)，DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)。精液分析系统(WLJY9000，北京伟力公司)。兔单克隆抗体Chk1(EP691Y，凯基生物公司)，小鼠单克隆抗体β-actin(mAbcam 8226，凯基生物公司)。Trizol试剂盒(Invitrogen 公司)，RT-PCR试剂盒(TIANGEN公司)，BCA法蛋白定量检测试剂盒(凯基生物公司)，蛋白分子Marker试剂盒(14KD-116KD，凯基生物公司)，ECL检测试剂盒(凯基生物公司)。

1.3 精液常规分析

按《WHO人类精液检查与处理实验室手册》操作标准，采用精液分析系统，对正常精子组、少精子组、弱精子组和少弱精子组进行精液浓度和总活力、前向运动力检测。

1.4 引物设计

经过调研，国内重点大学和省属老牌院校几乎都成功申请了“省级、国家级计算机实验教学示范中心”建设项目。国内高校的计算机实验教学示范中心蓬勃发展，地方院校认识到了计算机实验中心建设与创新发展的重要性和迫切性，开始研究探索中心建设与改革措施。从现状看，地方高校计算机实验教学中心建设还存在许多问题，主要表现在以下方面。

引物序列均由上海生物工程公司合成，Chk1的引物序列：

上游 5′-GACTGGGACTTG-GTGCAAAC-3′，

下游 5′-CGGCACGCTTCA-TATCTACA-3′。

β-actin(QIAGEN)为内参照。

1.5 四组精子中Chk1 mRNA的表达水平检测

采用qRT-PCR法检测各组精子中Chk1 mRNA的表达水平。精液标本离心(13000r/min)10 min后，弃上清液，将白色沉淀物用PBS液[pH7.2(0.01mol/L)]洗涤3遍。精子置于1.0 mLTrizol提取液中。精子总RNA提取依照操作说明书进行，使用Nanodrop 2000试剂盒测定总RNA浓度，提取后的RNA测A260-A280吸光值，要求A260/A280比值≥2.0，并计算出RNA含量。配制琼脂糖凝胶检查其完整性。根据天根Fastquant cDNA第一链合成试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成(上海生物工程公司)。涡旋混匀后离心(13000r/min)10 min，置PCR仪上孵育(42℃)3 min后迅速置于冰上冷却。再在上述PCR管中加入10 μL试剂(10×Fast RT Buffer2μL+RT Enzyme Mix 1μL+FQ-RQ Primer Mix 2μL+RNase-free ddH2O 5μL)。

涡旋混匀后按如下条件在PCR仪上进行逆转录反应：42 ℃ 15 min(反转录反应)，95 ℃ 3 min(灭活反转录酶)，4 ℃反应结束后置-80 ℃冰箱备用。根据天根SuperReal荧光定量试剂盒配制20 μL反应体系(2×SuperReal Premix Plus 10μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，上下游引物各0.6μL，cDNA模板2μL，不足量用RNase-free ddH2O补足)。在实时检测扩增仪上进行扩增， 反应条件为93 ℃预变性15 min，93 ℃ 10s，58 ℃ 32 s，共做40个循环。反应结束后根据样本及内参的△CT，以2-△△CT统计数据。

1.6 四组精子中Chk1蛋白的表达水平检测

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 精液常规参数比较

精液常规参数相关指标见表1。与正常精子组相比，少精子组、弱精子组和少弱精子组的浓度、总活力和前向运动力均显著降低(P<0.05) 。

Table 1 The comparison of sperm parameters in the normal，oligozoospermia，asthenospermia，and oligoasthenozoospermia groups(±s)

*：与正常精子组比较P<0.05；▲：与少精子组比较P<0.05；#：与弱精子组比较P<0.05.

2.2 四组精子中Chk1mRNA的表达变化

Chk1mRNA的检测结果见表2。对比于正常精子组，少精子组、弱精子组、少弱精子组中的Chk1mRNA表达量都下降。少精子组为0.67±0.12、弱精子组为0.42±0.04、少弱精子组为0.36±0.04，正常精子组中Chk1mRNA的表达明显高于其他各组(P<0.05)。

Table 2 The expressions of sperm Chk1 mRNA and protein in four groups

*：与正常精子组比较P<0.05；▲：与少精子组比较P<0.05；#：与弱精子组比较P<0.05.

2.3 四组精子中Chk1蛋白的表达变化

Chk1蛋白检测结果见表2、图1。Chk1/β-actin灰度比值在正常精子组、少精子组、弱精子组、少弱精子组中的分别为0.90±0.05、0.78±0.07、0.77±0.06、0.68±0.07，对比于正常精子组，Chk1在其余三组中的表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

1：正常精子组(Normal group)；2：少精子组(Oligozoospermia group)；3：弱精子组(Asthenospermia group)；4：少弱精子组(Oligoasthenozoospermia group)

图1四组精子细胞Chk1蛋白的表达结果图

Figure1TheexpressionsofspermChk1proteininfourgroups

3 讨论

近来，长期高原低氧环境对人体生殖机能的影响开始受到关注。国外报道[8]，进入高海拔(海拔5200m)低氧环境的男性登山员，其体内睾酮水平在经过7周的低氧环境暴露后显著下降。在研究慢性低氧对精子产生和男性生育力的影响的文献报道中显示[9]，健康男性在低氧环境暴露26天后，出现精子浓度降低、精子活力减弱，但这种影响在返回海平面6个月后可以恢复至先前正常水平。长期处于高原低氧环境下，随着海拔高度的升高男性精液质量下降更为明显[10]。

精子DNA完整性检测已成为评价精子质量的重要指标之一。研究表明[11]，精子DNA甲基化和精子DNA碎片率呈明显负相关性，对比于正常男性，精子DNA碎片率在男性不育患者中显著升高。以往报道[12]已揭示，高原低氧环境可以诱导机体产生氧化应激反应，氧化应激可产生过多的活性氧，导致精子质量下降，增加精子DNA损伤率，加速生殖细胞凋亡[13]。

Chk1是生物进化过程中的蛋白激酶，Chk1mRNA和蛋白主要表达在S期和G2期，Chk1是G2DNA损伤校验的核心，是通过Cdc25C的磷酸化来应答DNA损伤[14]。当DNA受损时，Chk1可以使细胞及时进行响应，甚至停滞其细胞周期的进程，而且还能启动修复DNA损伤的信号[15]。

在对小鼠受精卵的研究过程中，Wang B等[16]发现，由于氧化应激造成精子DNA损伤后，Chk1可有效修复受损的DNA。这一研究可证实高表达Chk1有利于细胞的自我修复。研究发现[17]，Chk1的低表达可导致DNA损伤检测点丧失作用，进而影响到细胞损伤后的修复功能。Chk1的正常表达可确保DNA复制在整个细胞分裂过程中的稳定性和完整性。因此，在对不孕不育症机制的研究中，Chk1能否正常的表达具有重要意义。然而，中度海拔的环境下男性精液质量降低是否与Chk1的表达异常有关，目前尚未见报道。

本研究在分子水平上对各组精子中Chk1的表达进行检测发现，各组精子都存在Chk1基因和蛋白的表达，少精子组、弱精子组和少弱精子组精子中Chk1 mRNA及蛋白表达量显著低于正常精子组，且在少弱精子组中表达量最低。提示长期处于中度海拔低氧环境下，男性精液质量下降可能与Chk1mRNA及蛋白表达量降低有关。

综上所述，中度海拔地区汉族人群男性不育患者精液质量降低与Chk1基因表达下调的相关性研究，将为该地区男性生殖机能的研究提供新的方向。然而中度海拔地区低氧环境引发Chk1基因降低的机理还需进一步的深入研究。本研究利用分子生物学技术揭示中度海拔低氧环境下男性精液质量下降的可能发生机制，为深入探讨中度海拔低氧环境引起的精子DNA损伤在分子生物学水平的研究奠定基础。也为少、弱及少弱精子症的预防、治疗开辟了新的思路和途径。

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