SHOX2基因甲基化与肺癌

钟彤 杨双强

SHOX2基因甲基化与肺癌

钟彤 杨双强

在全球范围内，肺癌是癌症死亡的首要原因，肺癌死亡人数占癌症死亡人数的20%[1]，目前肺癌相对五年生存率仅为18%[2]。改善肺癌的低生存率依耐于早期诊断及合理治疗。目前已经证明低剂量CT作为早期肺癌的筛查手段可以降低肺癌死亡率[3]，但假阳性率较高，因此，以无创或微创方式获取的标本检测肺癌标志物以辅助肺癌诊断及鉴别诊断，仍然具有很大价值。

近10多年来，DNA甲基化作为一种新型肿瘤标志物得到了广泛研究，涉及到众多基因的甲基化。研究发现，人矮小同源盒基因2(Short Stature Homeobox 2，SHOX2，又名OG12、SHOT、OG12X)基因甲基化可以在肺癌患者不同类型标本中检测到，作为肺癌标志物用于肺癌诊断具有突出的敏感性和特异性。本文对近几年来SHOX2 基因甲基与肺癌诊断、治疗监测及指示预后的相关研究进行综述。

一、SHOX2基因及其甲基化与肺癌的关系

SHOX2基因定位于3号染色体长臂(3q25.32),其长度为10kb，包含7个外显子，SHOX2基因还包含两个大的CpG岛，一个位于5，端，长1kb，另一个位于3，端，长500bp。SHOX2基因属于同源盒基因家族，这一基因家族编码的蛋白均含有一个由60个氨基酸组成的模体，是一个DNA结合域。同源盒基因编码的蛋白作为转录调节因子与脊椎动物及无脊椎动物的形态发生相关，有几个人类遗传性疾病是同源盒基因异常引起。SHOX2 基因在胚胎期表达于中胚层和外胚层，在骨骼和心脏发育中起重要作用，SHOX2 基因异常与先天性身材矮小相关[6-9]。

DNA甲基化是表观遗传学的一个重要研究领域。DNA甲基化发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)双核苷酸中胞嘧啶的第5位碳原子上，由DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases,DNMT)所催化[10]。DNA甲基化参与了个体发育和细胞分化等基本生物学过程[11]。而在人类多种恶性肿瘤中均发现有DNA甲基化异常，包括基因启动子区域的高甲基化和全基因组低甲基化[12-13]，基因启动子区域高甲基化是导致基因沉默的机制之一[14]。抑癌基因启动子区域高甲基化导致抑癌基因失活，是肺癌发生的早期事件[15]。关于肺癌DNA甲基化的研究显示，DNA甲基化分析可能成为肺癌早期、精确诊断的强有力工具，具有优越的敏感性和特异性[16]。

近几年研究发现，SHOX2 基因甲基化与肺癌有密切关系。肺癌患者肿瘤组织[17-18]、支气管灌洗液[19-21]、外周血[22-24]、胸腔积液[25-26]、纵隔或肺门淋巴结[27-28]五种标本中均可检测到SHOX2 基因甲基化。SHOX2 基因甲基化是肺癌的普遍现象，癌组织中SHOX2 基因甲基化检出率为96%[17]。而在支气管灌洗液、血浆、纵隔或肺门淋巴结标本中SHOX2 基因甲基化检出率也较高，说明这些标本中的SHOX2 基因甲基化状况可以很好地反应肺癌组织中SHOX2 基因甲基化，故可以成为辅助肺癌诊断的标志物。研究显示，SHOX2 基因甲基化在肺癌不同病理类型、不同分期中检出率存在差异[17，19，20，22]，吸烟与肺癌组织中SHOX2 基因甲基化显著相关[18]，这些均提示SHOX2 基因甲基化与肺癌发生发展紧密关联，但其中具体机制仍有待进一步研究，并可能是很有前景的研究方向。

二、肺癌不同类型标本中SHOX2 基因甲基化检测可辅助肺癌诊断

研究证实，SHOX2 基因甲基化可以作为一个新的肺癌标志物，辅助肺癌诊断具有突出的敏感性和特异性。一项Meta分析显示，检测SHOX2 基因甲基化辅助肺癌诊断的敏感性为70%，特异性达到96%[29]，这一Meta分析纳入的研究所涉及到的标本包括肺癌组织、淋巴结、血浆、支气管灌洗液、胸腔积液，涉及到1129个肺癌病例。检测这些标本中的SHOX2 基因甲基化辅助肺癌诊断可能被用于不同的临床情况中。目前主要使用甲基化特异性PCR技术(试剂盒)来检测标本中SHOX2 基因甲基化。

1. 肺癌组织

Schneider等研究发现，与对应形态学表现正常的癌旁组织相比，96%的肺癌组织标本中可检测出SHOX2 基因高甲基化(n=55)[17]，说明SHOX2 基因甲基化是肺癌中一个普遍现象，故可以作为肺癌的标志物。此外，肺癌组织中SHOX2基因高甲基化还伴随普遍的SHOX2基因扩增，两者高度相关(P<0.0001)，但这一研究并未在肺癌组织中检测到SHOX2 mRNA转录水平的明显变化[17]，SHOX2基因高甲基化与扩增在肺癌发生发展中的作用及其机制仍有待进一步研究。

2. 支气管灌洗液

肺癌病人支气管灌洗液与肺癌组织中SHOX2 基因甲基化有较高的一致性，故可以较好地反应肺癌组织中SHOX2 基因甲基化情况。肺癌病人支气管灌洗液中SHOX2 基因甲基化检出率为64%-83.8%(即敏感性为64%-83.8%)，特异性可达到84.6%-98%，具有很大的临床应用价值[19-21,23]。Bernd Schmidt等[19]分析了523例病人(肺癌281例，对照组242例)支气管灌洗液标本中SHOX2基因甲基化情况，发现在支气管灌洗液细胞学检查阴性的肺癌患者标本中，SHOX2 基因甲基化检出率为62%[19]，由此可见，特别是在疑诊肺癌而支气管灌洗液细胞学检查又为可疑或阴性的患者中，SHOX2 基因甲基化检测辅助肺癌诊断具有更大的价值[19]。不同病理类型中，鳞癌和小细胞肺癌SHOX2基因甲基化检出率分别为82%和97%，而腺癌仅为47%。不同分期中，Ⅰ期肺癌SHOX2 甲基化检出率低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌(分别为54%,72%,73%,68%)，这可能是Ⅰ期肺癌患者灌洗液中肿瘤细胞较少的缘故[19]。Dietrich等[20]也得出与Schmidt等相似的结果。此外，中央型肺癌患者支气管灌洗液SHOX2 基因甲基化检出率为68%，较周围型高(56%)[19]。

临床实践中，经第一次纤维支气管镜检查就能确诊的肺癌病例不到50%[30]。因此，在那些纤支镜及细胞学检查可疑或阴性的肺癌疑诊病例中，进一步行支气管灌洗液SHOX2 基因甲基化检测有助于肺癌的诊断及鉴别，从而可能避免行进一步的有创性检查。目前，已有用于支气管灌洗液中SHOX2 基因甲基化检测辅助肺癌诊断的商业化试剂盒[20]。

支气管灌洗液SHOX2 基因甲基化作为肺癌诊断标志物，显著优点是具有高度特异性(98%)，这种特异性可能是源于其取材部位的特异性，因支气管灌洗液直接取材于可能发生病变部位的支气管，不受其他部位病变的干扰。但因为纤支镜检查属有创检查，故支气管灌洗液SHOX2 基因甲基化检测不大可能用于大规模人群的肺癌筛查。

3. 外周血

在癌症进展过程中，肿瘤细胞释放DNA进入血液循环(血游离循环DNA)，故可以在外周血(血清或血浆)中检测到包括DNA甲基化标志物在内的肿瘤DNA标志物[31-33]。研究分析了血浆中SHOX2基因甲基化情况，表明血浆中SHOX2基因甲基化也可作为肺癌诊断标志物。Kneip等[22]研究发现，肺癌患者血浆中SHOX2 基因甲基化检出率为60%，即SHOX2 基因甲基化检测诊断肺癌敏感性60%，特异性为90%[22]。鳞癌和小细胞肺癌血浆中SHOX2基因甲基化检出率明显高于腺癌(分别为63%、80%和39%)，Ⅰ期肺癌标本中的甲基化检出率也明显低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期(分别为27%,72%,55%,83%)[22]，这些结果均与支气管灌洗液中的结果吻合[19-20]。进一步的分析表明，病理类型和分期与血浆SHOX2 基因甲基化存在明显关联[22]。而Konecny等的研究中肺癌病人血浆SHOX2 基因甲基化检出率更高(80.65%)，鳞癌和小细胞肺癌病人标本SHOX2甲基化检出率均为100%，腺癌为67%[23]。

最近，Weiss等报道了检测血浆中SHOX2和PTGER4基因甲基化组合可以鉴别肺癌和肺良性病变，同时分析这两个甲基化标志物，其诊断肺癌的敏感性为67%，特异性为90%[24]。

检测血浆SHOX2 基因甲基化诊断肺癌最大的优势在外周血标本获取方便，并可重复采取标本，操作方便，故有望应用于大规模肺癌筛查试验。目前也已经有商业化试剂盒用于外周血标本中SHOX2 基因甲基化检测[23]。

4. 胸腔积液

胸腔积液在临床工作中很常见，鉴别其良恶性是临床诊疗的重要内容。Llse等报道，以细胞病理学检查作为诊断肺癌恶性胸腔积液标准，发现肺癌恶性胸腔积液中SHOX2 基因甲基化检出率为40%[25]。国内的一项研究也得出相似的结果，肺癌恶性胸腔积液中SHOX2 基因甲基化检出率为35.7%[26]。这些研究说明，胸腔积液标本中SHOX2 基因甲基化检测辅助肺癌诊断也有一定价值。

5. 淋巴结

有研究报道了肺癌病人纵隔、肺门淋巴结中SHOX2 基因甲基化的情况[27-28]。Darwiche等[28]分析了经气管超声内镜引导针吸活检术(EBUS-TBNA)获取的纵隔、肺门淋巴结标本中SHOX2基因甲基化，发现在有肺癌转移淋巴结中SHOX2 基因甲基化检出率为94%，与肺癌原发病灶(96%)中相符合[17]，SHOX2 基因甲基化检出肺癌转移淋巴结的敏感性为94%，特异性达到99%，较EBUS-TBNA标本病理学检查的敏感性高(82%)[28]，故SHOX2 基因甲基化检测可以辅助EBUS-TBNA病理活检提高诊断及肺癌分期准确性，从而更好地指导临床治疗。

三、SHOX2基因甲基化用于肺癌治疗监测及指示预后

Schmidt等[34]研究发现血浆SHOX2 基因甲基化可用于晚期肺癌治疗的监测。以CT检查作为是否对治疗(化疗及根据情况放疗)发生应答的金标准，通过定量分析对比晚期肺癌病人(非小细胞肺癌和小细胞肺癌)治疗前和治疗开始后不同时间点血浆中SHOX2 基因甲基化水平，发现在对治疗有应答组病例中，血浆SHOX2基因甲基化水平随治疗周期数的增加而逐渐下降。他们证实，血浆SHOX2 基因甲基化可以反映接受系统治疗的晚期肺癌病人临床进程，检测SHOX2 基因甲基化可以在治疗开始一周后以较高的特异性区分出对治疗发生应答和无应答的病例，可以较CT更敏感、更早地发现患者是否对治疗产生应答，从而指导治疗方案的调整，或使患者免于一些无效治疗[34]。但由于这项研究仅纳入36例病例，其结论仍有待于在大样本试验中验证。

Dietrich等分析了400多例非小细胞肺癌肿瘤组织中SHOX2和PITX2基因甲基化情况并经过随访研究发现，SHOX2和PITX2 基因高甲基化可以预测无进展生存期。与两个基因都呈较高水平甲基化的病人相比，那些SHOX2和/或PITX2 基因低甲基化水平病人术后肿瘤进展的风险显著增高[35]。这一研究提示SHOX2和PITX2 基因甲基化可以作为非小细胞肺癌疾病进展独立的预后标志物，这也进一步提示SHOX2和PITX2 基因甲基化在肺癌发生发展中可能起着重要作用。

四、展望与结语

有研究报道了检测痰、呼出气冷凝物等无创途径获取的标本中p16INK4a,MGMT，RASSF1A, DAPK,APC,RARβ2，CDH1等基因甲基化[36-40]来检测肺癌也有较高的敏感性和特异性。而目前还未见检测痰标本中SHOX2 基因甲基化用于肺癌诊断的研究报道。因支气管灌洗液SHOX2 基因甲基化诊断肺癌有较高的敏感性和特异性，故推测，痰中的SHOX2 基因甲基化辅助诊断肺癌也可能有较高的敏感性和特异性，若这一点被将来的研究证实，则痰标本因其完全无创的特点可能被用于SHOX2 甲基化检测的大规模肺癌筛查或肺癌诊断试验。

研究已提示SHOX2 基因甲基化与肺癌发生发展有密切关系，但仍有待进一步探究。总的来说，SHOX2 基因甲基化作为肺癌的一个标志物，在肺癌诊断、治疗监测及预后评估中都可能发挥一定价值，特别是在肺癌诊断方面，已经显示出巨大的临床应用前景，可能成为目前肺癌诊断方法的重要补充。此外，还可联合检测其他肺癌DNA甲基化标志物，以期达到肺癌早期、精确诊断、减少诊断性有创检查及降低医疗费用的目的。

[1] Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J?Cancer,2015,136(5):E359-E386.

[2] Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer Statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1):7-30.

[3] Aberle DR,Adams AM,Berg CD,et al.Reduced lungcancer mortality with low-dose computed tomographic screening[J].N Engl J Med,2011,365(5):395-409.

[4] Massion PP,Walker RC.Indeterminate pulmonary nodules:risk for having or for developing lung cancer[J].Cancer Prev Res(Phila),2014,7(12):1173-1178.

[5] Aberle DR,DeMello S,Berg CD,et al. Results of the two incidence screenings in the National Lung Screening Trial[J].N Engl J Med,2013,369(10):920-931.

[6] Blaschke RJ,Monaghan AP,Schiller S,et al.SHOT,a SHOX-related homeobox gene, is implicated in craniofacial,brain,heart, and limb development[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(5):2406-2411.

[7] Blaschke RJ,Hahurij ND,Kuijper S,et al.Targeted mutation reveals essential functions of the homeodomain transcription factor Shox2 in sinoatrial and pacemaking development[J].Circulation,2007,115(14):1830-1838.

[8] SHOX2 short stature homeobox 2[Homo sapiens(human)][DB/OL].[2017-03-12].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6474.

[9] Smith TM,Lozanoff S,Iyyanar PP,et al.Molecular signaling along the anterior-posterior axis of early palate development[J].Front Physiol，2013，3(1):488-501．

[10]Robertson KD.DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web[J].Oncogene,2002,21(35):5361-5379.

[11]Robertson KD.DNA methylation and human disease[J].Nat Rev Genet,2005,6(8):597-610.

[12]Jones PA,Baylin SB.The fundamental role of epigenetic events in cancer[J].Nat Rev Genet,2002,3(6):415-428.

[13]Esteller M.Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps[J].Nat Rev Genet,2007,8(4):286-298.

[14]Herman JG,Baylin SB.Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation[J].N Engl J Med,2003,349(21):2042-2054.

[15]Langevin SM,Kratzke RA,Kelsey KT.Epigenetics of Lung Cancer[J].Transl Res,2015,165(1):74-90.

[16]Tsou JA,Hagen JA,Carpenter CL,et al.DNA methylation analysis: a powerful new tool for lung cancer diagnosis[J].Oncogene,2002,21(35):5450-5461.

[17]Schneider KU,Dietrich D,Fleischhacker M,et al.Correlation of SHOX2 Gene Amplification and DNA Methylation in Lung Cancer Tumors[J].BMC Cancer,2011,11:102.

[18]Dietrich D,Hasinger O,Liebenberg V,et al.DNA Methylation of the Homeobox Genes PITX2 and SHOX2 Predicts Outcome in Non-small-cell Lung Cancer Patients[J].Diagn Mol Pathol,2012,21(2):93-104.

[19]Schmidt B,Liebenberg V,Dietrich D,et al.SHOX2 DNA Methylation is a Biomarker for the Diagnosis of Lung Cancer Based on Bronchial Aspirates[J].BMC Cancer,2010,10:600.

[20]Dietrich D,Kneip C,Raji O,et al.Performance evaluation of the DNA methylation biomarker SHOX2 for the aid in diagnosis of lung cancer based on the analysis of bronchial aspirates[J].Int J Oncol,2012,40(3):825-832.

[21]Ilse P,Biesterfeld S,Pomjanski N,et al.Analysis of SHOX2 Methylation as an Aid to Cytology in LungCancer Diagnosis[J].Cancer Genomics Proteomics,2014,11(5):251-258.

[22]Kneip C,Schmidt B,Seegebarth A,et al.SHOX2 DNA methylation is a biomarker for the diagnosis of lung cancer in plasma[J].J Thorac Oncol,2011,6(10):1632-1638.

[23]Konecny M,Markus J,Waczulikova I,et al.The value of SHOX2 methylation test in peripheral blood samples used for the differential diagnosis of lung cancer and other lung disorders[J].Neoplasma,2016,63(2):246-253.

[24]Weiss G,Schlegel A,Kottwitz D,et al.Validation of the SHOX2/PTGER4 DNA Methylation Marker Panel for Plasma-Based Discrimination between Patients with Malignant and Nonmalignant Lung Disease[J].J Thorac Oncol,2017,12(1):77-84.

[25]Ilse P,Biesterfeld S,Pomjanski N,et al.SHOX2 DNA Methylation Is a Tumour Marker in Pleural Effusions[J].Cancer Genomics Proteomics,2013,10(5):217-223.

[26]栗少飞，聂立功.胸水中SHOX2 基因甲基化程度与肺癌的关系[J].医药与保健,2014,22(2):2-5.

[27]Leiro-Fernández V,De Chiara L,Botana-Rial M,et al.Viability of Lymph Node Samples Obtained by Echobronchoscopy in the Study of Epigenetic Alterations in Patients With Lung Cancer[J].Arch Bronconeumol,2014,50(6):213-220.

[28]Darwiche K,Zarogoulidis P,Baehner K,et al.Assessment of SHOX2 methylation in EBUS-TBNA specimen improves accuracy in lung cancer staging[J].Ann Oncol,2013,24(11):2866-2870.

[29]Zhao QT,Guo T,Wang HE,et al.Diagnostic value of SHOX2 DNA methylation in lung cancer: a meta-analysis[J].Onco Targets Ther,2015,8:3433-3439.

[30]Roth K,Hardie JA,Andreassen AH,et al.Predictors of diagnostic yield in bronchoscopy: a retrospective cohort study comparing different combinations of sampling techniques[J].BMC Pulm Med,2008,8:2.

[31]van der Drift MA,Hol BE,Klaassen CH,et al.Circulating DNA is a non-invasive prognostic factor for survival in non-small cell lung cancer[J].Lung?Cancer,2010,68(2):283-287.

[32]Yoon KA,Park S,Lee SH,et al.Comparison of circulating plasma DNA levels between lung cancer patients and healthy controls[J].J Mol Diagn,2009,11(3):182-185.

[33]deVos T,Tetzner R,Model F,et al.Circulating methylated SEPT9 DNA in plasma is a biomarker for colorectal cancer[J].Clin Chem,2009,55(7):1337-1346.

[34]Schmidt B,Beyer J,Dietrich D,et al.Quantification of Cell-Free mSHOX2 Plasma DNA for Therapy Monitoring in Advanced Stage Non-Small Cell (NSCLC) and Small-Cell Lung Cancer (SCLC) Patients[J].PLoS One,2015,10(2):e0118195.

[35]Dietrich D,Hasinger O,Liebenberg V,et al.DNA Methylation of the Homeobox Genes PITX2 and SHOX2 Predicts Outcome in Non-small-cell Lung Cancer Patients[J].Diagn Mol Pathol,2012,21(2):93-104.

[36]Guzmán L,Depix MS,Salinas AM,et al.Analysis of aberrant methylation on promoter sequences of tumor suppressor genes and total DNA in sputum samples: a promising tool for early detection of COPD and lung cancer in smokers[J].Diagn Pathol,2012,7:87.

[37]Sterlacci W,Tzankov A,Veits L,et al.A comprehensive analysis of p16 expression, gene status, and promoter hypermethylation in surgically resected non-small cell lung carcinomas[J].J Thorac Oncol,2011,6(10):1649-1657.

[38]Palmisano WA,Divine KK,Saccomanno G,et al.Predicting Lung Cancer by Detecting Aberrant Promoter Methylation in Sputum[J].Cancer Res,2000,60(21):5954-5958.

[39]Cirincione R,Lintas C,Conte D,et al.Methylation profile in tumor and sputum samples of lung cancer patients detected by spiral computed tomography: A nested case-control study[J].Int J?Cancer,2006,118(5):1248-1253.

[40]Xiao P,Chen JR,Zhou F,et al.Methylation of P16 in exhaled breath condensate for diagnosis of non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2014,83(1):56-60.

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.07.049

400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院胸外科

杨双强，E-mail：yysqiang2@163.com

2016-11-15]