地中海贫血实验室诊断技术进展

蒙绍建

（广西马山县妇幼保健院检验科，广西 南宁 530699）

地中海贫血实验室诊断技术进展

蒙绍建

（广西马山县妇幼保健院检验科，广西 南宁 530699）

地中海贫血是一类以α或β珠蛋白链合成障碍为特征的溶血性贫血病，是人类最常见的单基因遗传病之一。临床为了提高地中海贫血的诊断准确率，降低漏诊以及误诊情况，有必要综合应用实验室各类技术，加强研究，发现更有效、更合适的诊断方法。本研究具体就近些年实验室有关地中海贫血的各类不同诊断技术的情况进行综合论述。

地中海贫血；实验室诊断；技术进展

地中海贫血（thalassemiasl）属于隐性遗传性疾病的一种，主要特征是珠蛋白B链、α链缺失或者合成不足，临床出现最多的是β地中海贫血以及α地中海贫血[1]。从我国疾病分布情况来看，南方的发病率要高于北方，主要在香港、海南、广东、广西等地分布[2]。临床对于地中海贫血具体类型的诊断必须进行地中海贫血的相关检测，研究发现，进行血红蛋白电泳以及开展基因检测能实现地中海贫血相对准确的诊断，同时可以实现地中海贫血类型的鉴别[3]。对贫血类型进行准确鉴别有助于指导临床针对贫血的治疗，防止临床滥用铁剂治疗贫血，从而避免地中海贫血患者受到损害。从当前实验室技术来看，对于地中海贫血的检测具体包括基因诊断法以及筛查法两种，下文进行具体的论述。

1 基因诊断

分子诊断是基因诊断的另一种说法，其用于分析检验对象某一个转录物（mRNA）或者特定基因（DNA），从而诊断遗传病的一类技术。从我国情况来看，针对地中海贫血的基因诊断在近些年一共经历了6个发展阶段，具体包括DNA点杂交、限制性内切片段长度多态性（RFLP）链锁分析、聚合链酶反应（PCR）体外基因扩增、寡核苷酸（ASO）探针杂交、限制性内切酶酶谱分析、芯片技术，尤其是其中的聚合链酶反应（PCR）体外基因扩增，当前已经成为实验室应用最多的一种方法。

1.1 RFLP链锁分析

DNA上面特定的核苷酸序列经DNA限制性内切酶可以完成识别并切割，因此可以得到相应长度的DNA片段，除此之外，碱基突变可能导致酶切位点丢失，也会使得酶切位点形成，这样会促使酶切片段大小被改变[4]。突变的基因在经相关限制性内切酶水解之后，会改变电泳条带的大小以及数量，依照这类变化能够对突变的存在与否进行判断。但是限制性内切片段长度多态性（RFLP）链锁分析的不足在于无法将受检者突变基因的类型直接测出，同时这一分析操作起来难度较大。

1.2 寡核苷酸(ASO)探针杂交

通过引物扩增珠蛋白基因的，合成寡核苷酸探针，其和正常以及突变序列完全为互补关系。点上PCR扩增产物于尼龙膜上，将正常、突变ASO探针分别完成杂交并进行标记，假设探针不能实现彻底互补，在特定条件下可彻底洗脱，然后经放射自显影全面的对杂交结果进行观察[5]。寡核苷酸（ASO）探针杂交这一方法灵敏、快速，但是也存在不足，有很高的DNA数量以及纯度上的要求。当前寡核苷酸（ASO）探针杂交这一方法较多应用于β-地中海贫血基因诊断。

1.3 PCR体外基因扩增

其是一类基因体外扩增技术，DNA聚合酶在PCR的利用下，于体外完成一对引物间的特异DNA片段催化合成。α-地中海贫血的基因诊断中PCR基础诊断的应用逐渐增多，尤其针对多重PCR，其特点是有4对等位基因的特异引物包含在一个PCR体系内，按照不同突变位点完成特异扩增，然后完成结果判定。多重PCR法检测右及左缺失、α-珠蛋白基因东南亚缺失。多重PCR可实现对缺失型α-地中海贫血的鉴别，还能够实现其的基因分型[6]。通过单管多重PCR的应用，能够将（右及左缺失、α-珠蛋白基因东南亚缺失）迅速、准确的检测出来，对于α-地中海贫血产前诊断、分子筛查意义突出。

1.4 Southrrn印迹杂交

这重点是用于鉴别DNA靶分子杂交，指的是DNA杂交DNA，在固相支持物上将经电泳分离的等待检测的DNA片段完成转印以及结合，继续选择DNA标记探针检测待测的DNA。这一方法可检测基因缺失状态，截至当前，这一方法对于α-地中海贫血的诊断依旧是α-地中海贫血基因诊断的标准。

1.5 缺口PCR（Gap-PCR）

缺口PCR的原理是进行2对或者3对引物的设计，也就是在趋势区域的外侧，在与缺失位点临近的地方进行1对引物的设计，在缺失区域里面进行1对引物的设计。在正常人和杂合子中处于缺失区域中的引物能扩增片段，同时如果是处于缺失纯合子，则不能扩增。一对引物处于缺失区域外侧，因缺失两端DNA原本距离很远，变得靠近，因而可完成扩增特定DNA片段，从而对纯合子患者实现准确诊断。研究发现，通过缺口PCR方法的应用，可以将三种缺失型地中海贫血准确检测出来。缺失序列、设计引物两侧翼序列互补，原本正常情况下处在断裂点两侧翼相距遥远的引物由于基因缺失突变变得临近，因而能实现一定长度片段的扩增；缺失区域有另外一对引物，当处于杂合子情况或完全正常情况下，才能够完成正常等位基因的扩增。这一方法依据扩增片段大小能实现正常杂合子、纯合子个体的准确区分。

1.6 反向点杂交法（PCR-RDB）

和等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交原理相比，反向点杂交法的原理存在很大相似性，但是也存在不同，将以往固定靶DNA利用膜上固定探针取代，通过一次杂交能够检测未知样品之间的多种突变，使得传统杂交法仅仅能够对一种突变进行检测这一不足得到改进，反向点杂交法的主要特点包括操作简便、敏感度高、获取检测结果速度快，是近些年国内以及国外使用较多的一种检测技术。有学者通过反向点杂交法对β-珠蛋白基因有没有发生17个点的突变进行同时检测，获得了满意的效果[7]。并且反向点杂交法还能够将突变的具体类型：正常基因、杂合子、纯合子、双重杂合子准确区分出来，对于我国比较多发的β-地中海贫血基因检测非常适用。且该方法还可诊断非缺失型α-地中海贫血突变。

1.7 荧光PCR

相较于普通PCR，荧光PCR的敏感度要高出超过1000倍，选择各个颜色的荧光素标记PCR扩增产物，在DNA测序仪上面将各个片段、不同颜色PCR扩增产物实现同时检测，所以可分辨正常、纯合子或者杂合子。经荧光PCR基因扫描，能对一些地区β珠蛋白基因突变进行检测，荧光PCR的主要特点包括有较高灵敏度、检测迅速、操作简便等，并且不需要大量DNA样本。

1.8 基因芯片

依基因芯片上不同位置可观察的荧光位点颜色不同以及强弱变化实施地中海贫血基因突变类型的判断，相较于以往的传统方法，基因芯片方法基于核酸扩增基础，通过荧光标记引物延伸，能够使检测结果的特异性以及敏感性得到提升。并且因为基因芯片具有高通量这一特点，所以能够在同一张芯片上完成α、β地中海贫血的基因诊断。这一方法更适用于大面积普查，这一方法的主要特点包括省时、方便。

2 筛查法

2.1 测定血常规

低色素以及小细胞是地中海贫血的最典型特征，MCH＜27 pg、MCV＜80 fl则是血液学中最重要的指标，符合上述标准的可能是缺铁性贫血或者地中海贫血。将MCH以及MCV作为初筛地中海贫血的方法价值明显。

2.2 对红细胞形态学进行检查

具体有涂片、瑞氏染色，由于贫血程度会有明显差别，所以相应红细胞可能会表现为不均匀的大小，存在很多不同异常形态，出现靶形红细胞或者嗜碱性点彩红细胞等。越严重的贫血，就会出现越明显的异形性。

2.3 对不稳定血红蛋白进行测定

（1）热变性试验：相较于正常血红蛋白，不稳定血红蛋白在温度升高的时候，发生沉淀的可能性很大。处于50℃-60℃温度下，α-地中海贫血的沉淀量会偏高[9]。但是这一方法缺乏较高的敏感度，并且受比色影响比较大，但是相较于异丙醇试验，这一方法的特异性更高。

（2）异丙醇试验：地贫血液中血红蛋白存在比较不稳定，在37℃的温度中且浓度为17%的异丙醇溶液中不稳定血红蛋白在5分钟内会发生沉淀，在20分钟时会有絮状形成。

2.4 血红蛋白电泳

实验室中对于异常血红蛋白的识别以及检测最常应用血红蛋白电泳这一方法，具体包括以下几种。

（1）珠蛋白肽链聚丙烯酰胺凝胶电泳：经尿素解离血红蛋白，组建多肽链，不同肽链的分离通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子筛效应和电荷，获取各个区带，假设不同类别珠蛋白链合量、结构有异常，珠蛋白链就会发生区别正常的变化，经测定不同区带含量比例，能够对各珠蛋白基因的表达进行了解，还能够基本上将β0-β+、α-地中海贫血检测出来[10]。但是这一方法也存在不足，操作比较复杂，试剂存在比较大的毒性，结果稳定性不满意，可能导致珠蛋白链假阳性。

（2）自动琼脂糖凝胶电泳：点样前调整Hb含量为8～12 g/L，稍微稀释已经制备的Hb液，再加入加样杯中，经定量仪器添加样本到加样孔，设置仪器500 V、20℃，实施电泳处理，时间为25分钟，完成后取出，置于仪器染色位置，完成对应程序的设定，经仪器自动功能完成各个环节的操作，包括冲洗和染色，脱色以及烘干。结束之后，电泳胶片直接在全自动密度扫描仪上扫描定量各个成分，得出扫描图谱。经全自动琼脂糖凝胶对血红蛋白进行电泳后，显示其对异常Hb有非常高的分辨力，新生儿Hb Bart，s含量等微量成分能够清晰显示1.0%-3.0%的区带，实现准确的扫描以及定量。

（3）高效液相色谱（HPLC）：当前这一方法多用于HbA2以及HbF的定量分析。有研究证实，通过这一方法的阴阳离子交换层析仪可以实现血红蛋白的自动化分析，同时完成测定抗碱血红蛋白，能够得到稳定结果，且检测非常简便迅速。特别针对β-珠蛋白生成障碍性贫血，HPLC能快速实现诊断。

（4）毛细管区带电泳（CEl）：毛细管区带全自动电泳法是在石英管（充满缓冲液）中实施电泳的方法。溶血试剂中置入的红细胞样品进行稀释后在毛细管阳极端进行注射，通过高电压的作用完成分离，在阴极端415nm的波长下对血红蛋白各组分含量进行直接检测。这一方法能够自动鉴别以及定量HbA2区带，能够有效区分聚焦HbA以及HbS间的HbF，同时能够对其开展精准的测量。

3 结 语

由于科学技术的进步，实验室当前对于地中海贫血的检测在技术方面也得到显著提高，基因诊断以及筛查技术成熟度不断提高。基因分析用于地中海贫血的诊断可靠性最高，不过这一方法操作比较复杂、需要花费的时间比较长、对操作人员的技术要求也非常高的，所以还无法广泛推广。因此临床必须继续加强研究，不断推出更快速方便、更准确，更便于推广的地中贫血的检测技术，为临床诊断和治疗地中海贫血提供更科学的指导依据。

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本文编辑：吴玲丽

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ISSN.2095-8242.2017.16.3167.02