强直性脊柱炎活动期患者血瘀状态相关细胞因子/NF-κB信号通路情况及新风胶囊干预机制

孙立明, 魏芳晶

·临床论著·

强直性脊柱炎活动期患者血瘀状态相关细胞因子/NF-κB信号通路情况及新风胶囊干预机制

孙立明1, 魏芳晶2

目的 探讨新风胶囊对强直性脊柱炎(AS)患者由免疫炎症介导的血瘀证的影响及干预机制。方法 将42例AS患者作为观察组，选取同期40名健康志愿者作为对照组。观察组服用新风胶囊，每次1.5 g，每日3次，连续服药3个月。采用ELISA法检测两组外周血免疫和血瘀状态相关细胞因子含量，并采用RT-PCR及Western blot法检测NF-κB信号通路相关指标基因、蛋白表达变化。结果 与对照组比较，观察组治疗前外周血PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6等细胞因子含量均显著升高(P<0.05)，而IL-4和IL-10含量均显著降低(P<0.05)。观察组采用新风胶囊治疗3个月后，PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6均较治疗前显著降低(P<0.05)，IL-4和IL-10含量均显著提高(P<0.05)。观察组治疗前外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表达和p65、p50蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05)。观察组治疗3个月后IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表达和p65、p50蛋白表达均较治疗前显著降低(P<0.05)。结论 新风胶囊能有效改善AS患者由免疫炎症介导的血瘀证，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路活化、维持机体Th1/Th2动态平衡状态有关。

强直性脊柱炎;血瘀;NF-κB信号通路;新风胶囊

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一类发病晚期脊柱呈“竹节样”变化的进行性自身免疫性疾病，多发于青壮年男性，其病因隐匿，病程缓慢而缠绵，误诊率及致残率很高[1-2]。目前，AS的确切发病机制尚不明确，临床上缺乏有效的治疗方案。新风胶囊是我国自主研发的具有健脾化湿通络功效的中成药，近年来大量临床数据显示其在改善AS患者由免疫炎症介导的血瘀证方面具有良好疗效[3]。本研究通过观察AS患者在新风胶囊治疗前后外周血细胞因子及核转录因子(NF-κB)信号通路相关指标的变化，初步研究新风胶囊的作用机制，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 病例与对照 选择2014年3月～2015年6月内蒙古医科大学第二附属医院门诊及住院的42例AS患者作为观察组，其中男32例，女10例，年龄23～48(33.12±5.46)岁，病程1.40～18.60(12.14±3.56)年。患者诊断均符合美国风湿病协会(ACR)1984年修订的强直性脊柱炎纽约诊断标准。排除标准：① 脊柱出现严重畸形者；② 1个月内使用过肾上腺皮质激素、免疫抑制剂者；③ 研究者认为不宜参与该项研究的受试者。选取同期本院体检中心的40名健康志愿者作为对照组，已排除自身免疫性疾病，其中男30例，女10例，年龄23～49(33.26±5.35)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过内蒙古医科大学第二附属医院伦理委员会批准，纳入研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 TransScript®Two-Step RT-PCR SuperMix试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；纤溶酶原抑制剂-2(PAI-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血栓烷A2(TXA2)、前列环素(PGI2)、血小板α-颗粒膜蛋白(GMP140)、白细胞介素(IL)1β、IL-6、IL-4、IL-10 ELISA试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人p50单抗、鼠抗人p65单抗和兔抗人β-actin单抗均购自Santa Cruz公司(美国)。37℃恒温培养箱购自Thermo公司(美国)，AB17500型荧光定量PCR仪购于AppliedBiosystems公司(美国)，Elx800-UV酶标仪购于BioTek公司(美国)，倒置光学显微镜(奥林巴斯CKX-41)购自奥林巴斯株式会社(日本)。

1.3 治疗方案 观察组服用新风胶囊(安徽中医药大学第一附属医院制剂中心生产，批号：201205291，规格：0.5 g/粒)，每次1.5 g，每日3次，连续服药3个月[4]。在治疗期间可根据病情需要服用非甾体抗炎药物，不能加服其他免疫抑制剂及治疗本病的药物。

1.4 血清中相关细胞因子含量测定 两组患者均于治疗前后取清晨空腹静脉血10 ml，室温下静置2 h后3 000 r/min离心15 min，分离血清。采用ELISA试剂盒检测血清中PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10的含量，具体操作步骤严格按照说明书相关规定进行。

1.5 RT-PCR实验 取1.4项下的静脉血离心沉淀，采用RT-PCR法检测NF-κB信号通路相关指标IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表达。参照试剂盒说明书分别提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA，以β-actin为内对照进行PCR扩增，目的基因的引物设计是根据GeneBank提供IκBα、IKKβ、p65、p50的mRNA序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(见表1)。采用ImageJ软件对条带进行半定量分析，测出各条带IOD值，以β-actin作为内参照。

表1 目的基因的引物设计

1.6 Western blot实验 取1.4项下的静脉血离心沉淀，收集细胞用PBS洗涤2次，加入1×SDS上样缓冲液300 μl，冰上放置30 min，超声裂解细胞，4℃，15 000 r/min条件下离心10 min，收集上清为细胞裂解液。用BCA法进行蛋白定量，10% SDA-PAGE垂直电泳分离，上样量为30 μg/孔，转移蛋白质到聚乙烯二氟膜上，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，1 ∶1 000 稀释的鼠抗人p65单抗、1 ∶1 000稀释的鼠抗人的p50单抗、1 ∶4 000稀释的兔抗人的β-actin单抗室温孵育1 h，膜洗3次，加入1 ∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗鼠或抗兔的二抗室温孵育1 h，膜洗3次，用ECL发光系统进行显影，采用ImageJ软件对条带进行半定量分析，测出各条带IOD值，以β-actin作为内参照。

2 结果

2.1 两组外周血血清细胞因子含量比较 见表2。与对照组比较，观察组治疗前外周血PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6等细胞因子含量均显著升高(P<0.05)，而IL-4和IL-10含量均显著降低(P<0.05)。观察组采用新风胶囊治疗3个月后，PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6均较治疗前显著降低(P<0.05)，IL-4和IL-10含量均显著提高(P<0.05)，同时TXA2、PGI2、GMP140含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 两组外周血血清细胞因子含量比较±s)

与对照组比较：*P<0.05；与治疗前比较：#P<0.05

2.2 新风胶囊对AS患者外周血的 IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA 基因表达影响 见表3、图1。采用RT-PCR检测AS患者外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表达情况，结果显示，与对照组相比，观察组治疗前外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表达均显著升高(P<0.05)。观察组采用新风胶囊治疗3个月后，外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表达均较治疗前显著降低(P<0.05)。

表3 两组IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表达情况

与对照组比较：*P<0.05；与治疗前比较：#P<0.05

图1 两组IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表达情况

2.3 新风胶囊对AS患者外周血p65、p50蛋白表达影响 见表4、图2。Western blot检测两组MCF-7细胞的p65、p50蛋白表达，结果显示，与对照组比较，观察组治疗前p65、p50蛋白表达均显著升高(P<0.05)。观察组采用新风胶囊治疗3个月后，p65、p50蛋白表达均较治疗前显著降低(P<0.05)。

表4 两组p65、p50蛋白表达情况

与对照组比较：*P<0.05；与治疗前比较：#P<0.05

图2 两组p65、p50蛋白表达

3 讨论

3.1 AS的中医学病机分析 AS是一种全身性自身免疫疾病，可导致髋关节损害、中轴关节疼痛及颈部、腰背强直且活动不利等，严重降低患者的生活质量,中医将其归于“痹证”范畴[5]。AS患者脉络痹阻不通，气滞血瘀，瘀结不散，筋脉失养，不温煦四肢，发展为筋挛骨松，关节变形，难以行走[6]。目前临床上主要通过 PAI-2、TXA2、PGI2、GMP140 等指标反映血瘀证，其中 PAI-2 是尿激酶型纤溶酶原激活剂的高效专一抑制剂，抑制纤溶酶原激活物诱导的血纤蛋白凝块的溶解；TXA2 是一种血栓素，可以激活血小板、使其聚集；PGI2是血栓素的对抗剂，它的合成减少可促进血栓形成；GMP140 是血小板活化释放的特异标志之一，可反映体内血小板的活化程度及血栓形成倾向[7-8]。本研究中，观察组治疗前外周血 PAI-2、TXA2、PGI2、GMP140 等细胞因子含量均显著高于对照组(P<0.05)，提示AS患者普遍存在血瘀证。

3.2 新风胶囊的主要成分和临床应用 新风胶囊是我国自主研发的具有健脾化湿通络功效的中成药，其由黄芪、雷公藤、薏苡仁、蜈蚣等多味中药材组成。方中黄芪补气固表、托疮生肌，雷公藤具有抗炎及免疫抑制作用，薏苡仁除痹、排脓、解毒散结，蜈蚣息风解痉，全方具有健脾化湿通络功效[9]。近年来，临床研究证实新风胶囊能有效改善AS患者的血瘀证，盛长健 等[4]研究证实新风胶囊治疗强直性脊柱炎患者具有良好临床疗效并能改善患者的生活质量。本研究结果显示，观察组在采用新风胶囊治疗3个月后 PAI-2、TXA2、PGI2、GMP140均较治疗前显著降低(P<0.05)，提示新风胶囊有助于改善AS患者由免疫炎症介导的血瘀证。

3.3 新风胶囊治疗AS的作用机制 NF-κB 作为信号转导的枢纽，它通过调控大量基因转录，释放 TNF-α、IL-10和IL-1β 等细胞因子，是机体免疫反应的关键调控者[10]。本研究中，观察组治疗前外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA 基因表达和 p65、p50 蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05)，提示 AS 患者的 NF-κB 信号通路处于高活化状态。而 AS 患者采用新风胶囊治疗3个月后IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA 基因表达和 p65、p50 蛋白表达均较治疗前显著降低(P<0.05)，提示新风胶囊可能通过抑制NF-κB信号通路活化，调节细胞因子的变化，从而维持机体 Th1/Th2 动态平衡状态，降低炎症反应。

细胞因子作为关节炎症的重要介质，是 AS 免疫炎症主要参与者。本研究发现 AS 患者 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量显著高于健康人群(P<0.05)，而 IL-4和IL-10 含量均显著低于健康人群(P<0.05)。正常情况下，TNF-α、IL-1β、IL-6 作为机体重要的免疫炎症因子，其功能往往受到 IL-4、IL-10 等抑制炎症反应的细胞因子制约，从而维持正常机体的 Th1/Th2 动态平衡。本研究结果提示，AS 患者存在 Th1/Th2 失衡，并且失衡向免疫炎症方向漂移。观察组采用新风胶囊治疗3个月后 TNF-α、IL-1β、IL-6 均较治疗前显著降低(P<0.05)，IL-4和IL-10 含量均显著提高(P<0.05)，同时 TXA2、PGI2、GMP140 含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示新风胶囊改善AS患者血瘀证可能与维持Th1/Th2 平衡状态、减轻免疫炎症反应有关。

AS 患者血瘀证的发生涉及诸多基因的激活以及信号的调控，NF-κB 作为信号转导的枢纽，它在血瘀证发展过程中起着决定性作用。新风胶囊能有效改善 AS 患者由免疫炎症介导的血瘀证，其作用机制可能与抑制 NF-κB 信号通路活化，维持机体 Th1/Th2 动态平衡状态有关。

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(接收日期：2016-12-24)

The relationship between blood stasis condition and cytokine/NF-κB signaling pathway in patients with ankylosing spondylitis and the intervention mechanism of Xinfeng capsule

SUNLi-ming,WEIFang-jing

(1DeptofInspection,theSecondAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot,InnerMongolia010030,China；2DeptofCardiology,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot,InnerMongolia010050,China)

Objective To explore the relationship between blood stasis condition and cytokine/NF-κB signaling pathway in patients with ankylosing spondylitis and the intervention mechanism of Xinfeng capsule. Methods A total of 42 patients with ankylosing spondylitis were selected as observation group, and 40 healthy subjects were enrolled as control group. Observation group taked Xinfeng capsule, each 1.5 grams, 3 times every day, continuous medication for 3 months. The blood immune and blood stasis cytokine were detected by ELISA, and NF-κB signaling pathway indicators gene and protein expression were measured by RT-PCR and Western-blot. Results Compared with control group, the content of PAI-2, TNF-α, TXA2, PGI2, GMP140, IL-1β and IL-6 in observation group significantly increased pre-treatment(P<0.05), and IL-4, IL-10 significantly decreased(P<0.05). The content of PAI-2, TNF-α, TXA2, PGI2, GMP140, IL-1β and IL-6 significantly decreased after the observation group were treated with the Xinfeng capsule treatment for 3 months(P<0.05), and IL-4, IL-10 significantly increased(P<0.05). The gene expression of IκBα， IKKβ, p65, p50 mRNA and the protein expression of p65, p50 in the observation group before treatment showed higher than control group(P<0.05), and those showed lower after treated with the Xinfeng capsule treatment for 3 months(P<0.05). Conclusions Xinfeng capsule can improve inflammation in patients with AS by the immune-mediated blood stasis, and the mechanisms could related to down-regulated expression of NF-κB and maintain body Th1/Th2 state of dynamic equilibrium.

ankylosing spondylitis;blood stasis;NF kappa B signaling pathway;Xinfeng capsule

10.3969/j.issn.1008-0287.2017.01.018

1内蒙古医科大学第二附属医院检验科,内蒙古 呼和浩特 0100302内蒙古医科大学附属医院心内科,内蒙古 呼和浩特 010050

孙立明,男，硕士,主管检验,主要从事医学检验研究,E-mail:158481750@qq.com； 魏芳晶,女,博士,教授,主任医师,通讯作者,主要从事冠心病介入治疗研究及心脏干细胞移植、基因治疗研究, E-mail:jingjixw@163.com

R 681.51;R 593.23;R 286

A

1008-0287(2017)01-0038-04