育龄大熊猫阴道源乳酸杆菌的分离鉴定与系统进化

马晓平，杨天意，俞 演，张志和，王承东，古 玉

(1.四川农业大学 动物医学院/动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都611130； 2.成都大熊猫繁育研究基地，四川 成都610000； 3.中国保护大熊猫研究中心，四川 雅安 625000； 4.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014)

育龄大熊猫阴道源乳酸杆菌的分离鉴定与系统进化

马晓平1，杨天意1，俞 演1，张志和2，*，王承东3，古 玉4，*

(1.四川农业大学 动物医学院/动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都611130； 2.成都大熊猫繁育研究基地，四川 成都610000； 3.中国保护大熊猫研究中心，四川 雅安 625000； 4.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014)

旨在对大熊猫阴道源乳酸杆菌进行分离与鉴定。取发情期大熊猫阴道分泌物为试验组，人阴道分泌物为对照组，对其乳酸杆菌进行分离培养，形态学、生化特性、16S rDNA特征鉴定及系统进化分析。结果显示，通过API 50CHL系统鉴定生化特性，结合16S rDNA序列测定和系统进化分析，共分离到6株革兰氏阳性乳酸杆菌，分别为从大熊猫阴道分泌物中分离到的唾液乳酸杆菌GPV01、植物乳酸杆菌GPV02和LactobacillussaerimneriGPV03，从对照组人阴道分泌物中分离得到嗜酸乳酸杆菌WAV01、卷曲乳酸杆菌WAV02和植物乳酸杆菌WAV03，大熊猫和人阴道中均存在植物乳酸杆菌(分别为GPV02和WAV03)。该结果可为后续研究大熊猫阴道乳酸杆菌生物学特性及开发大熊猫阴道益生菌奠定基础。

大熊猫；阴道；乳酸杆菌；系统进化

大熊猫是现今世界上极其珍稀的大型哺乳动物之一，其以特殊的科学价值和独特的观赏价值为人们所喜欢，由于它的繁殖能力极低，种群数量少，虽然近年来大熊猫人工授精技术已取得显著成果，但仍存在少数育龄大熊猫屡配不孕的情况[1]。阴道微生态的紊乱及细菌性阴道病与雌性育龄大熊猫屡配不孕有密切联系[2]。正常阴道菌群与雌激素分泌水平等有关。其中乳酸杆菌是健康妇女阴道中的优势菌群，阴道中95%以上的微生物是乳酸杆菌，它通过分泌H2O2、有机酸、细菌素及类细菌素等物质来发挥其益生菌功能，在阴道中承担着维持阴道菌群平衡，调节阴道内环境稳定的作用[3]。本研究用非生理期育龄妇女阴道分泌物样本作为对照，从发情期大熊猫阴道中取样，对大熊猫和妇女阴道分泌物中的乳酸杆菌进行分离培养，并通过生化和分子生物学方法对其进行种属的鉴定。以期为了解大熊猫生殖道微生态以及后期尝试开发大熊猫阴道益生菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验样本

2014年3—5月从中国保护大熊猫研究中心碧峰峡基地采集14只育龄、临床健康，全身未使用抗生素及任何其他药品的圈养雌性大熊猫(4～10岁)阴道分泌物样本14份，并从5名非月经期女性(22～30岁)采集阴道分泌物样本5份(由雅安市妇幼保健院帮助采样)作为对照。

1.2 试验仪器设备和试剂

PCR扩增仪(PE-2400，Perkin Applied Biosystems)；高速冷冻离心机(Eppendorf，德国)；GelDoc XR+ BIO-RAD全自动凝胶成像系统(Bio-Rad,美国)；数码照相装置(Olympus DP70，日本)；电泳仪(JY600C，君意东方电泳设备有限公司)。细菌基因组和DNA提取试剂盒均购自TianGen公司，16S rDNA扩增引物由上海立菲生物公司合成，胰蛋白胨等试剂购自杭州微生物生化试剂有限公司。API 50CHL乳酸菌鉴定系统(梅里埃)。

1.3 试验样本的采集与处理

雌性育龄大熊猫自然发情后尝试自然交配失败，用盐酸氯胺酮等对大熊猫麻醉后人工授精前，用无菌的棉拭子伸入大熊猫阴道蘸取分泌物，随后立即放入装有MRS肉汤培养基的EP管中恒温保存，2 h内带回实验室，37 ℃厌氧增菌培养24 h。将无菌棉拭子伸入供试妇女阴道中，蘸取适量阴道分泌物后，立即放入装有MRS肉汤培养基的EP管中恒温保存，2 h内带回实验室，37 ℃厌氧增菌培养24 h。

1.4 乳酸杆菌的分离

普通固体MRS培养基的基础上加2%的无水碳酸钙，115 ℃灭菌 20 min，制作改良MRS固体平板。用接种环取大熊猫和人阴道分泌物增菌培养后的培养液分别划线接种于改良MRS固体平板，37 ℃恒温厌氧培养24～48 h，挑取不同形态的菌落进行纯培养，革兰氏染色镜检。选取G+无芽孢的杆菌为疑似菌株进行分子生物学鉴定和生理生化鉴定。

1.5 乳酸杆菌的鉴定

1.5.1 乳酸杆菌的试剂条鉴定

用乳酸菌鉴定系统API 50CHL鉴定初步分离到的G+无芽孢杆菌。用对数生长期菌体制备2McF的菌悬液接种于API 50CHL的试剂条记录第一次结果。之后置于厌氧环境中37 ℃培养24 h，记录第二次结果。再次置于厌氧环境下37 ℃培养24 h，记录第三次结果，形成生化反应谱，将反应谱提交到代理公司经API软件分析获得结果。

1.5.2 乳酸杆菌的16S rDNA鉴定

挑取G+杆菌进行分子生物学鉴定，提取细菌基因组DNA作为模板进行16S rDNA PCR扩增，引物序列如下：16S F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；16S R:3’-GGTCTACCTTGTTACGACTT-5’阳性扩增产物送上海立菲生物技术有限公司测序，测序结果在GenBank 基因库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行比对。将测序获得的16S rDNA序列与从GenBank数据库中得到的相似性较高的序列(表1)用MEGA5.1软件序列分析，同时绘制进化树。

2 结果与分析

2.1 初步分离结果

本次共从14份样本中分离得到3株乳酸杆菌(表2 中GPV01、GPV02、GPV03，图2中的A、B、C)。健康人阴道分泌物样本分离得到3株乳酸杆菌(表2中WAV01、WAV02、WAV03，如图1中的D、E、F)。均仅在一个样本中分离出1株乳酸杆菌。结果如图1和表2。

表1 从GenBank中获得的乳酸杆菌高相似性序列

Table 1 The sequences of high similarity toLactobacillusacquired from GenBank

编号No.菌种Species菌株号Strains序列注册号GenBankaccessionNO.1Lactobacillussalivarius3-1-60AB9325312LactobacillussalivariusATCC11741AF0891083LactobacilluscrispatusJCM7697AB9114564LactobacillussaerimneriNBRC107826AB6260795LactobacillusplantarumDSM20205M588276LactobacillusbrevisATCC14869M588107LactobacilluscurieaeS1L19JQ0865508LactobacillusseniorisYIT12364AB6025709LactobacillussunkiiYIT11161AB36638510LactobacillusotakiensisYIT11163AB36638611Lactobacillussp.JKD6AF26470112LactobacillusfarraginisNRIC0676AB26273113LactobacillusjenseniiATCC25258AF24317614LactobacilluscrispatusJCM7702AB91145915LactobacillushelveticusDSM20075AM11377916LactobacillusacidophilusCMUL67KF73866916LactobacillusacidophilusCMUL67KF738669

表2 不同样本乳酸杆菌初步分离结果

Table 2 Preliminary separation results ofLactobacillusisolated from different samples

样本编号SampleID菌株数Strainnumber编号StrainserialnumberCC1GPV01ZM1GPV02WJ1GPV03WOMAN-11WAV01WOMAN-21WAV02WOMAN-31WAV03

GPV 代表菌株从大熊猫阴道分泌物中分离得到；WAV代表菌株从妇女阴道分泌物中分离得到；01、02、03表示分离到的第几株。

GPV represents vaginal secretions of giant panda; WAV represents vaginal secretions of women; 01， 02， 03 represent number of strain.

2.2 生理生化鉴定结果

对分离到的6株疑似乳酸杆菌，采用API 50 CHL系统进行生理生化鉴定，生化反应谱见表3。其鉴定ID值在85以上为可接受结果，在85以下为不确定结果。本次分离到的6株乳酸杆菌可初步鉴定到种，其鉴定反应谱见表3。将生理生化特性结果输入API 50CHL鉴定系统比对后初步鉴定结果：GPV01为唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)，GPV02为植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)，GPV03为发酵乳酸杆菌(Lactobacillusfermenti)，WAV01为嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus)，WAV02为卷曲乳酸杆菌(Lactobacilluscrispatus)，WAV03为植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)。

A， GPV01; B， GPV02; C. GPV03; D， WAV01; E， WAV02; F， WAV03. Gram staining. The magnification is 1 000 times图1 分离的6种细菌形态和革兰氏染色特性Fig.1 Morphology and Gram’s stain characteristics of the 6 bacterial

表3 乳酸杆菌生化鉴定反应谱

Table 3 Identification ofLactobacillusbased on physiological and biochemical characteristics

测试项目TestitemGPV01GPV02GPV03WAV01WAV02WAV03空白对照Blankcontrol------甘油Glycerinum------赤癣醇Erythritol------D-阿拉伯糖D-(-)-Arabinose------L-阿拉伯糖L-Arabinose--+--+/-核糖Ribose-+----D-木糖D-xylose------L-木糖L-xylose------阿东醇Adonit------β-甲基-D-木糖甙β-methyl-D-xyloseglycoside------半乳糖Galactose++/-++/-+/-+葡萄糖Glucose++++++果糖Fructose++++++甘露糖Mannose+++++/-+山梨糖Sorbose------鼠李糖Rhamnose+/------卫茅醇Dulcitol------肌醇Inositol------甘露醇Mannitol++---+山梨醇Sorbitol+----+α-甲基-D-甘露糖甙α-methyl-D-mannoseglucoside-----+α-甲基-D-葡萄糖甙α-methyl-D-glucoseglucoside------N-乙酰-葡糖胺N-acetylglucosamine++-+/-++苦杏仁甙Amygdalin-+-+/-+/-+熊果甙Arbutin-+/--+/-+/-+七叶灵Esculin-+/-++++柳醇Salicin-+/--+++纤维二糖Cellobiose-+/--+++麦芽糖Maltose++++++乳糖Lactose++/-++/-+/-+蜜二糖Melibiose+-+-+/-+蔗糖Sucrose+-++++海藻糖Trehalose---+/-+/-+菊糖Synanthrin------松叁糖Melezitose+----+棉子糖Raffinose--+-+/--淀粉Starch----+-糖原Glycogen----+/--木糖醇Xylitol------拢牛儿糖Geraniol-+-+--D-松二糖D-(+)-Turanose-----+D-来苏糖D-(-)-Lyxose------D-塔格糖D-(-)-Tagatose------D-岩糖D-fucose------L-岩糖L-fucose------D-阿拉伯糖醇D-arabitol------L-阿拉伯糖醇L-arabitol------葡萄糖酸盐Gluconate-----+2-酮基-葡萄糖酸盐2-keto-gluconate------5-酮基-葡萄糖酸盐5-keto-gluconate------

+，阳性反应；-，阴性反应；+/-，介于阳性与阴性之间。

+， Positive reaction; -， Negative reaction; +/-， Interposed between the positive and negative.

2.3 16S rDNA 鉴定结果

对疑似的乳酸杆菌进行纯培养，然后按照DNA提取试剂盒说明书提取纯培养物DNA，选取细菌通用引物进行16S rDNA扩增，扩增结果如图2所示。

将扩增产物送上海立菲生物技术有限公司测序，测序结果在GenBank(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)中进行比对(表4)。本次共分离得到6株乳酸杆菌(其核酸序列提交http://www. ncbi.nlm.nih.gov/ 分别获得如下序列号，KR072513、KR072514、KR072515、KR072516、KR072517、KR072518)，结合形态学、生理生化鉴定、分子生物学鉴定的结果，6株乳酸杆菌的最终鉴定结果为：GPV01为唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)，GPV02为植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)，GPV03为Lactobacillussaerimneri，WAV01为嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus)，WAV02为卷曲乳酸杆菌(Lactobacilluscrispatus)，WAV03为植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)。选取与其同源性最高的乳酸杆菌核酸序列进行同源性分析，构建neighbor-joining(NJ)进化树(图3)。从图中可见，6株乳酸杆菌均与GenBank中的同种的菌株序列达到99%以上同源性，表明分离到的菌株确为对应种的乳酸杆菌。

M，Marker；GPV01、GPV02、GPV03，大熊猫样本；WAV01、WAV02、WAV03，人样本。M， Marker; GPV01， GPV02， GPV03 are from giant panda; WAV01， WAV02， WAV03 are from women.图2 16S rDNA PCR扩增产物电泳图Fig.2 PCR products of 16S rDNA

3 讨论

对于微生物的分类鉴定，传统的鉴定方法是通过其形态学、生理生化、细胞组成等进行鉴定。目前，已研究发现乳酸杆菌属包括了102个种，种与种之间的生理生化反应和遗传结构都有很大程度上的相似性，使得对乳酸杆菌的分类鉴定较为困难。单独依靠表型的方法来鉴定乳酸杆菌是不客观的，还需结合分子生物学鉴定方法。细菌的16S rDNA在细菌的进化中具有高度的保守性，被认为是细菌分子的“活化石”， 但仍存在9～10个变异区使得不同种属的细菌间有着一定的差异，这也就成了细菌分类的标志[4]。为此，本文选取API 50 CHL试剂条，结合分子生物学方法进行鉴定。API 50 CHL试剂条是由49种可发酵碳水化合物的API 50 CHL试剂条组成的简易培养基[5]。将待测菌制成悬液接种于试剂条的每个小管中。当培养时，由于发酵碳水化合物产酸，pH下降，使指示剂变色[6]，结果生成菌株的生化反应谱，并用于鉴定或分型。

表4 六株疑似乳酸杆菌的比对结果

Table 4 Sequence comparison of the 6Lactobacillusstrains

菌株编号Strainnumber参考菌株Referencestrain相似性Similarity登录号AccessionnumberGPV01LactobacillussalivariusstrainCH-999%KR072514GPV02LactobacillusplantarumstrainPro34100%KR072513GPV03LactobacillussaerimneristrainGDA15499%KR072515WAV01LactobacillusacidophilusstrainFSI499%KR072516WAV02LactobacilluscrispatusstrainLE1099%KR072517WAV03LactobacillusplantarumstrainLp-C6399%KR072518

图3 基于16S rDNA核酸序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 6 Lactobacillus strains based on the 16S rDNA sequence

本试验共分离鉴定大熊猫阴道源乳酸杆菌3株，大熊猫和人阴道中均有乳酸杆菌且有相同种的乳酸杆菌。唾液乳酸杆菌GPV01、植物乳酸杆菌GPV02、嗜酸乳酸杆菌WAV01、卷曲乳酸杆菌WAV02和植物乳酸杆菌WAV03的生化鉴定结果与分子生物学鉴定结果一致，但GPV03在对数生长期进行了3次生理生化鉴定，均为发酵乳酸杆菌，而用分子生物学方法鉴定为L.saerimneri。因为生理生化鉴定的很多指标受细菌状态、活力等诸多相关因素的影响，故结果可能会从阳性变为阴性。该实验中GPV03的生理生化鉴定结果和分子生物学方法鉴定结果的不一致，可能是由此原因导致。细菌16S rDNA基因序列由保守区和可变区互相交错排列组成。编码基因具有高度的保守性，现有细菌DNA均由其上一代遗传下来。虽然在长期的进化过程中，细菌的基因会因为突变而有较大变化，但其祖先的某些痕迹仍留在其核苷酸序列中[7]。故经由16S rDNA基因序列做成的鉴定结果更为可信，故将GPV03鉴定为L.saerimneri。雷蕾等[8]，胡国全等[1]分别对9只和2只大熊猫阴道棉拭子进行分离培养，均认为乳酸杆菌是大熊猫阴道中的优势菌群。笔者前期采用454高通量测序对21只发情期雌性大熊猫阴道分泌物进行微生物多样性研究表明，大熊猫阴道的优势菌群是乳球菌属和肠球菌菌属，乳酸杆菌属只占0.01%，不是大熊猫阴道内优势菌群[9]。而本研究从14只大熊猫阴道分泌物中共分离得到3株乳酸杆菌，其分离率较低(3/14，21.4%)，与前期的高通量测序研究结果较为一致。乳酸杆菌是健康妇女阴道中的优势菌群，从健康女性的阴道排出物标本中分离率高达80%～100%[10]。本研究从5位健康成年女性阴道分泌物分离到3株乳酸杆菌，虽然分离率明显高于大熊猫阴道样本，但是其分离菌株明显较少。肖冰冰等[10]对不同年龄、不同生活习惯的女性进行阴道乳酸杆菌的分离，发现年龄越大，生活习惯差的女性其阴道乳酸杆菌的数量很少。不同地区的女性阴道乳酸杆菌分布情况有所不同，例如存在于西方女性阴道内的嗜酸乳酸杆菌 (Lactobacillusacidphilus)，并未在韩国女性阴道内发现，同时在韩国女性阴道内却找到了不存在于西方女性阴道内的鼠李糖乳酸杆菌，印度健康女性阴道内的优势菌为罗伊乳酸杆菌(LactobacillusIreuteri)、发酵乳酸杆菌和唾液乳酸杆菌(Lactobacillusalivarius)[11]。同理，不同地区不同饲养环境以及不同生理状态下的大熊猫，其阴道微生物的种类和数量不同。因为阴道微生态处于一个动态平衡。同时生殖道菌群组成受个体年龄、遗传背景、用药情况、激素水平和性行为等因素影响[3]。

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(责任编辑 卢福庄)

Isolation, identification and phylogenetic analysis ofLactobacillusfrom vagina of giant panda

MA Xiaoping1， YANG Tianyi1， YU Yan1， ZHANG Zhihe2,*， WANG Chengdong3， GU Yu4，*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Chengdu611130，China; 2.ChengduResearchBaseofGiantPandaBreeding，Chengdu610000，China; 3.ChinaConservationandResearchCenterfortheGiantPanda，Ya’an625000，China; 4.CollegeofLifeScience，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

In order to separate and identify theLactobacillusfrom vagina of giant panda， the vaginal secretions were taken from estrus female giant panda and women. The isolatedLactobacillusstrains were identified by morphology， biochemical characteristics， 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis. The results showed that a total of 6 gram-positiveLactobacillusstrains were obtained.LactobacillussalivariusGPV01，LactobacillusplantarumGPV02，LactobacillussaerimneriGPV03 were isolated from the vaginal secretion of the giant panda (test group)， andLactobacillusacidophilusWAV01，LactobacilluscrispatusWAV02，LactobacillusplantarumWAV03 were isolated from the vaginal secretion of the woman (control group). It was interesting that the giant panda and woman all hadL.plantarumin the vagina (GPV02 and WAV03). This result would lay the foundation for studying biological property of vaginaLactobacillusof giant panda and exploiting vaginal probiotics for giant panda.

giant panda; vagina;Lactobacillus; phylogenetics

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.03

2016-07-19

国家科技支撑计划项目(2012BAC01B06)；四川省科技厅基础研究计划项目(2013JY0175)；大熊猫国际资金项目(AD1415)

马晓平(1976—),男，土家族，重庆石柱人，博士，副教授，从事临床兽医学的教学科研工作。E-mail：mxp886@sicau.edu.cn

*通信作者，古玉，E-mail：guyu632@sicau.edu.cn；张志和，E-mail:zzh@panda.org.cn

S858.9；Q955

A

1004-1524(2017)02-0193-07