曲安奈德药物涂层可降解支架在兔胆管损伤动物模型的研究

宋 楠，夏医君，王 烯，贾广鹏，王 石*,谢忠士

(1.内蒙古医科大学,呼和浩特010010;2.内蒙古自治区人民医院 肝胆胰脾外科，呼和浩特010010;3.吉林大学中日联谊医院 胃肠结直肠外科，吉林 长春130033)

曲安奈德药物涂层可降解支架在兔胆管损伤动物模型的研究

宋 楠1，夏医君2，王 烯2，贾广鹏2，王 石2*,谢忠士3*

(1.内蒙古医科大学,呼和浩特010010;2.内蒙古自治区人民医院 肝胆胰脾外科，呼和浩特010010;3.吉林大学中日联谊医院 胃肠结直肠外科，吉林 长春130033)

目的 观察胆管内放置曲安奈德可降解胆道支架后胆管ɑ平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA)及转化因子β1(TGF- β1)在兔胆管损伤动物模型修复期间的表达情况，研究应用曲安奈德药物覆膜的可降解胆道支架在兔胆管损伤动物模型中抑制胆管炎性狭窄的机制。方法 通过兔胆管损伤动物模型将应用曲安奈德药物涂层的可降解胆道支架和无曲安奈德涂层可降解胆道支架分别放置兔肝外胆管60只，平均随机分成6组，选取放置胆道支架后第30天、60天、90天分别处死1组兔动物模型，取材兔损伤修复模型的胆管并且应用免疫组织化学的方法分别检测ɑ-SMA和 TGF-β1蛋白的表达水平。结果 曲安奈德可降解胆道支架组兔胆管SMA-ɑ和 TGF-β1与无曲安奈德涂层可降解胆道支架组相比表达减弱，曲安奈德可降解胆道支架组兔胆管狭窄,发生比无曲安奈德涂层可降解胆道支架组低。曲安奈德可降解胆道支架组第30天与第90天二组有差异性统计学意义(P<0.05),无曲安奈德涂层可降解胆道支架组第60天与第90天组二组有差异性统计学意义(P<0.05)。结论 曲安奈德药物覆膜可降解支架在兔胆管损伤动物模型修复期间胆管组织中ɑ-SMA和 TGF-β1两种蛋白表达量降低，提示曲安奈德药物覆膜可降解支架在抑制兔胆管损伤动物模型的炎性狭窄起到一定作用。

曲安奈德;可降解胆道支架;胆道 ɑ平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA);转化因子β1(TGF-β1)

(ChinJLabDiagn,2017,21:0285)

胆管损伤的发生多见于医源性损伤及外伤性胆管损伤，前者多见于各种开放性腹腔手术或腹腔的介入治疗以及腹腔内脓肿或囊肿穿刺治疗或病理诊断，上述操作过程中均有出现胆道损伤的可能，据统计腹部手术造成胆道损伤多发生于开放胆囊切除术，也有一部分发生于胆总管探查手术、针对肝脏实施的肝切除手术、胃的良恶性肿瘤实施胃大部切除术，胰腺的手术以及十二指肠的手术中也有发生胆道损伤的可能；肝脏肿瘤行肝动脉栓塞手术、肝移植手术可以并发胆管缺血性损伤，肝脏射频消融可以导致胆道热损伤等[1]。损伤后导致胆道狭窄目前是肝胆外科面临的疑难问题，临床表现为术后胆管瘢痕愈合和胆管狭窄，发生原因主要与胆管生物学特点有着密切关系。胆管系统分为肝内胆管和肝外胆管，胆管是由弹性纤维组成的管腔，在管腔内有胆汁及细菌的贮存，当发生损伤或感染后，可以刺激巨噬细胞游动聚集，多发生于胆管损伤愈合处，巨噬细胞可以合成大量的转化因子β1(TGF-β1)，转化因子β1作为媒介可以进一步促使粘膜下的纤维细胞发生转化，从而出现大量具有活跃功能的成纤维细胞，成纤维细胞可以造成愈合处出现过的胶原合成，胶原作为瘢痕形成的主要成分在管腔内不规则聚集，肉眼表现为在胆管内的瘢痕形成。转化因子β1(TGF-β1)作为刺激作为刺激因子能够对成纤维细胞造成持续性影响，导致成纤维细胞向肌成纤维细胞转化明显增多(MFB)。而在肌成纤维细胞(MFB)形成过程中，ɑ-SMA作为一种表达产物呈现明显增多的表达，如果ɑ-SMA其作为MFB分化产物明显增多，也提示肌成纤维细胞(MFB)生成过多。过多增多的肌成纤维细胞(MFB)进一步会导致胆管内瘢痕愈合。曲安奈德是临床常用的糖皮质激素类药物之一，其作用机制是抑制球蛋白、胶原酶抑制剂的生成，球蛋白、胶原酶抑制剂的减少导致胶原降解增加，胶原作为瘢痕形成的重要组成成分，可以明显减少成纤维细胞的生成，进一步炎症反应明显降低，纤维细胞的弹性蛋白作为最产物合成量显著降低。纤维细胞的弹性蛋白可以抑制成纤维细胞的凋亡和增殖，还可以明显降低成纤维细胞的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原mRNA的产生，从而可以达到抑制瘢痕的形成和增生[2]。本实验通过制作曲安奈德涂层多聚乳酸生物可降解胆道支架，并将其应用于兔胆管损伤动物模型，通过观察ɑ-SMA和TGF-β1两种蛋白在曲安奈德涂层多聚乳酸生物可降解胆道支架胆管损伤动物模型和无曲安奈德涂层多聚乳酸生物可降解胆道支架胆管损伤动物模型表达的情况，评价曲安奈德涂层多聚乳酸生物可降解胆道支架对医源性胆管损伤后瘢痕形成情况，进一步探讨其在损伤后炎性狭窄胆道中形成的作用机制，最终为临床预防胆管损伤后治疗过程中预防胆道狭窄提供更好的治疗方法。

1 材料和方法

1.1 制备含有曲安奈德涂层的可降解多聚乳酸生物胆道支架

多聚乳酸生物为主要组成成分可降解胆道支架制作由长春生物应化所高分子材料系完成，聚乙醇酸-聚羟基乙酸( PLLGA)聚合是主要的材料。含有曲安奈德涂层的可降解胆道支架组成成分为曲安奈德粉末、聚乙醇酸-聚羟基乙酸PLLGA，将上述成分磨碎制作成细小颗粒形状，按200 mg曲安奈德粉末，800 mg的聚乙醇酸-聚羟基乙酸PLLGA比例与曲安奈德粉末溶于共同溶剂20 ml的THF里面。最后将已经灭菌处理的事先制备的聚乙醇酸-聚羟基乙酸可降解胆道支架浸泡于刚刚制备的含有曲安奈德药物涂层液体中，片刻后拿出，在30℃/0.1Mpa条件下的真空烘干箱内烘干达到衡定重量。无曲安奈德药物涂层可降解胆道支架作为实验的对照组，涂层材料配方为800 mg 的聚乙醇酸-聚羟基乙酸PLLGA比例与曲安奈德粉末溶于共同溶剂20 ml的THF里面，按照制作曲安奈德药物涂层可降解胆道支架制作方法进行操作，最终制成无曲安奈德药物涂层可降解胆道支架备用。

1.2 实验动物及手术方式

雌雄各半的60只健康新西兰白兔购置于内蒙古农业大学，体重(2±0.5 kg)。将60只健康新西兰白兔随机分成2组，分为曲安奈德支架组(实验组)和裸支架组(对照组)，每组30只，分别于第30天、60天、90天分别处死曲安奈德支架组(实验组)和裸支架组(对照组)各10只。麻醉应用腹腔注射氯胺酮的方法。待实验动物被完全麻醉后，仰卧并固定四肢于动物手术台，实验动物腹部备皮，碘酒常规消毒后术区铺无菌手术巾单。手术切口采用上腹正中切口，游离后完全暴露第一肝门部区域，显示十二指肠韧带。显露十二指肠，并于十二指肠球部上方1.5 cm处将胆总管解剖出来，横行切开胆总管前壁直径的1/3-1/2，制作胆管损伤动物模型，勿超过胆总管的两侧缘。预先制备的含有曲安奈德涂层的可降解支架和无曲安奈德涂层的可降解支架放置于实验动物模型的胆总管内，应用5-0可吸收缝线做间断全层吻合，每针的距离为2-4 mm，每针距离边缘距离为2-4 mm。

1.3 标本采集和相关指标检查

曲安奈德涂层的可降解支架(实验组)和无曲安奈德涂层的可降解支架组(对照组)分别于术后第30天、第60天、第90天分别处死各10只新西兰白兔，采用上腹正中切口进入腹腔。入腹后肉眼观察腹腔内术后粘连程度以及经过实验缝合胆管的生长情况。用剪刀剪开胆管缝合口处观察大体标本，收集缝合口及缝合口上、下各0.5 cm胆管组织，10%福尔马林溶液常规固定，HE染色并针对ɑ-SMA、TGF-β1两种蛋白应用免疫组织化学染色的方法进一步观察二者的表达情况。ɑ-SMA一抗液试剂盒购置长春标新科技生物技术有限公司，操作步骤严格按照试剂盒说明进行操作。TGF-β1一抗液试剂盒购置Biovision公司，操作步骤严格按照试剂盒说明进行操作，通用型免疫组织化学二步法检测试剂盒购置于长春标新科技生物技术有限公司，操作步骤严格按照试剂盒说明进行操作。

1.4 结果判定

2 结果

2.1 实验动物大体组织形态学观察

所有实验组和对照组实验动物均顺利实施，术中麻醉效果佳，所有实验组和对照组均无术中实验动物的意外死亡。曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)和无曲安奈德涂层的可降解支架组(对照组)动物术后全部恢复良好，无意外死亡，均未出现胆道梗阻及胆瘘发生。肉眼观察术后30天曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)和无曲安奈德涂层的可降解支架组(对照组)实验动物可见胆管轻度水肿，胆道支架完整，并且位于胆管损伤缝合处无移动，损伤胆管良好愈合；肉眼观察曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)和无曲安奈德涂层的可降解支架组(对照组)实验动物，术后60天可见预先留置的可降解胆道支架完全降解，实验组吻合口未见狭窄，对照组胆管壁明显增厚，吻合口可见狭窄，损伤处的近端胆管扩张；肉眼观察曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)和无曲安奈德涂层的可降解支架组(对照组)实验动物，术后60天实验组胆管无明显扩张以及胆道狭窄的出现，对照组胆管壁增厚，吻合口明显狭窄、损伤处的近端胆管扩张较为明显。

2.2 两组实验动物ɑ-SMA表达情况 见表1。

表1 两组实验动物ɑ-SMA表达情况

表1结果提示，曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)术后第30天、第60天、第90天蛋白ɑ-SMA阳性表达及面积评分低于无曲安奈德涂层的可降解支架组(对照组)，进一步发现术后第60天和第90天两组的比较有统计学差异意义(P<0.05)。曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)术后第90天与术后第30和第60天蛋白ɑ-SMA 阳性表达及面积评分结果的比较有统计学差异意义(P<0.05)。

2.3 两组实验动物TGF- β1表达情况 见表2。

表2 两组实验动物TGF- β1表达情况

表2结果提示，曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)术后第30天、第60天、第90天TGF- β1阳性表达结果及面积评分的结果均低于无曲安奈德涂层的可降解支架组(对照组)，其中术后第60天和第90天两组的比较有统计学差异意义(P<0.05)。曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)术后第60天和第90天与术后第30天TGF- β1蛋白表达的 阳性结果及面积评分分布的的比较有统计学差异意义(P<0.05)。

3 讨论

胆道损伤后胆管发生纤维化狭窄是肝胆外科术后出现的并发症，也是肝胆外科医生的棘手问题。组织修复过程中伤口收缩是正常和必然出现的情况。假如肉芽组织出现过多的增殖和过度的收缩，那么可以组织修复过程中伤口收缩会导致出现挛缩的瘢痕，进一步可以出现一定程度的功能障碍。随着近年人们对肌成纤维细胞(MFB)与瘢痕挛缩二者关系进一步加深，可以明确肌成纤维细胞(MFB)可以导致瘢痕挛缩的发生[4]。

近年来，瘢痕组织内注射曲安奈德注射液，糖皮质激素类药物之一即醋酸曲安奈德，可以用于治疗瘢痕疙瘩，并起到很好的效果。在瘢痕组织内注射曲安奈德，不但能抑制胶原酶，而且还能抑制球蛋白抑制剂的分泌，而二者减少后可以导致胶原降解量的增加，胶原量减少的结果是导致成纤维细胞的增殖和胶原合成量减少，由于成纤维细胞的增殖和胶原合成量减少会抑制伤口的炎症反应的发生，成纤维细胞分泌以及合成的弹性蛋白降低[5]。最终起到抑制成纤维细胞的凋亡和增殖的作用，纤维细胞的弹性蛋白可以抑制成纤维细胞的凋亡和增殖，还可以明显降低成纤维细胞的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原mRNA的产生，从而可以达到抑制瘢痕的形成和增生，这就是曲安奈德治疗瘢痕的作用机制，作为治疗瘢痕的药物曲安奈德，在报道中多用于皮肤的瘢痕治疗，未见胆管损伤修复过程中用于对抗胆管纤维化狭窄的报道。

巨噬细胞可以合成大量的转化因子β1(TGF- β1)几年来很多实验性研究表明，其在瘢痕增殖和修复过程中起着重要的角色作用，不但在器官损伤修复过程中，而且还在炎症愈合过程中，以及组织发生纤维化的过程中的信号转导均扮演着重要的角色[6]。由此可见在愈合组织的修复过程中的各个阶段TGF- β1都是不可缺少的重要蛋白，进一步为受伤组织及器官修复提供必备的转导信号及物质基础，假如TGF- β1作为信号蛋白受到抑制、过度表达以及阻断发生后，进一步就会出现不良的组织愈合或以至于瘢痕形成。有文献报道，胆管损伤发生并行修复术后第3个月至第6个月之间，也就是常常称为晚期的伤口愈合阶段，检测发生狭窄的胆管组织，免疫组化学提示该组织中TGF- β1蛋白的表达量明显增高。这给笔者一个提示，如果能够人为的减少胆汁对炎症修复过程中刺激作用，就会降低修复过程中发生炎症反应的数量和程度，那么也能起到抑制TGF- β1过度表达的情况，这样就会为减少胆道损伤修复术后胆道瘢痕的过度增伤，同时也为预防胆管的言行狭窄提供理论基础。我们的实验基于上述的理论基础，想应用含有曲安奈德涂层的多聚乳酸支架，这种生物支架不仅是可以完全降解的支架，还是以二氧化碳和水为最终降解产物的支架，这两种产物绝对不可能对机体造成生物毒性，也明显抑制局部炎症反应的发生。作为胆管损伤后常规应用的“T”形硅胶引流管，不但可以对抗损伤修复后胆管的挛缩瘢痕的外界力，还能支撑吻合口避免狭窄，起到一定的支撑作用，帮助修复的吻合口愈合。我们应用的曲安奈德药物涂层可降解支架具备所有“T”形硅胶引流管功效，而且它的优势也很明显，曲安奈德药物涂层可以减少胆管修复组织与胆汁的接触；曲安奈德药物涂层的药物在分解过程中释放较为缓慢，最终可降解的支架完全降解后，缓慢缓释的药物效果也可以显现出来，常规应用的“T” 形硅胶引流管术后一定时间内需拔除，拔除过程中可能会出现并发症的发生，而可降解胆道支架避免了拔管的过程，有些病例应用金属支架出现不良反应也得到避免。通过我们的研究表明，曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)术后第30天、第60天、第90天TGF- β1阳性表达结果及面积评分的结果均低无曲安奈德涂层的可降解支架组(对照组)，其中术后第60天和第90天两组的比较有统计学差异意义(P<0.05)。曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)术后第60天和第90天与术后第30天TGF- β1蛋白表达的 阳性结果及面积评分分布的的比较有统计学差异意义(P<0.05)。提示作为曲安奈德药物载体的可降解胆道支架的缓慢释放有可能的机制是通过抑制过度表达TGF- β1蛋白量并且抑制TGF- β1蛋白的生物活性，最终可以起到抑制损伤胆管愈合过程中炎性纤维化和炎性狭窄的发生。

目前MFB的持续性增殖多发生于瘢痕的增生和炎性组织的纤维化持，我们也认为胆管损伤修复手术术后发生瘢痕性挛缩以及炎性狭窄的机制之一。成纤维细胞作为MFB的前体，而MFB作为产物使其在分化过程中会出现ɑ-SMA蛋白的表达，表达的ɑ-SMA蛋白在MFB分化过程中是标志性的产物，反过来提示如果ɑ-SMA蛋白的表达也代表MFB增殖明显[7]。给我们的提示，如果应用免疫组织化学方法检测胆管损伤修复组织中ɑ-SMA蛋白的表达量，也有着观测MFB的在瘢痕愈合中的生物学作用和愈合周期。通过我们的研究表明，曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)术后第30天、第60天、第90天蛋白ɑ-SMA阳性表达及面积评分高于曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)，进一步发现术后第60天和第90天两组的比较有统计学差异意义(P<0.05)。曲安奈德涂层的可降解支架组(实验组)术后第90天与术后第30和第60天蛋白ɑ-SMA 阳性表达及面积评分结果的比较有统计学差异意义(P<0.05)，提示曲安奈德涂层的可降解支架可以起到成纤维细胞向MFB转化的抑制作用。现今多项研究表明，曲安奈德作为糖皮质激素药物，对瘢痕组织中ɑ-SMA蛋白表达控制的作用机制还不是很清楚，预测有可能与瘢痕组织中TGF- β1蛋白表达有一定的关系。ɑ-SMA蛋白在TGF- β1蛋白的影响下可以对肌成纤维细胞的增殖起到一定作用[7]，曲安奈德作为可降解的涂层，能够进一步阻断TGF- β1蛋白信号系统，起到ɑ-SMA蛋白量明显减少的作用，ɑ-SMA可以抑制成纤维细胞转化为MFB 的数量，由于数量减少进一步可以抑制MFB功能。转化因子TGF- β1具备自分泌能力，通过这样的方式可以促进TGF- β1mRNA 的产生以及蛋白的表达量和分泌量均增加明显。炎性组织愈合过程中TGF- β1还可以加快成纤维细胞向MFB转化的进程，由于MFB的增多，也会反过来刺激TGF- β1蛋白与胶原蛋白的生成量，这样的正型作用机制可将TGF- β1蛋白的生成效应明显扩大，损伤愈合的胆管发生纤维化增厚也就不可避免了，如果能通过干预TGF- β1蛋白的数量和生物学活性，之前的正性作用被抑制，为胆管损伤愈合过程中抑制纤维化及炎性狭窄的发生提供一定的条件。

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Effect of Triamcinolone-eluting biodegradable stent in leporine bile duct after injury

SONGNan1,XIAYi-jun2，WANGXi2,etal.

(1.InnerMongoliaMedicalUniversity,InnerMongoliaAutonomousRegion,Hohhot010010,China;2.DepartmentofHapatopancreatobiliarySurgery,People’sHospitalofInnerMongoliaAutonomousRegion,InnerMongoliaAutonomousRegion,Hohhot010010,China;3.DepartmentofColorectal&AnalSurgery，China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity，Changchun130033，China)

Objective To investigate the effect of a biodegradable triamcinolone-eluting biliary polylactide stent on the expression -smooth muscle actin(ɑ-SMA)and transforming growth factor-bata1( TGF-β1) in leporine bile duct after injury.Methods The triamcinolone-eluting biliary polylactide stents were prepared by immersion method.A leporine bile duct injury model was established.Triamcinolone-eluting biliary polylactide stents were surgically inserted in the bile duce of 30 leporines in experimental group,while biodegradable without triamcinolone stent were placed in 30 leporines of control group.Animals were sacrificed 30,60,90 days after operation.The wound healing of common bile duct was observed.The expression of ɑ-SMA and TGF-β1was detected with immunohistochemical methon.Results The ɑ-SMA and TGF-β1were expressed lower than those in control group(P<0.05).In experimental group,the ɑ-SMA and TGF-β1were expressed lower than those in control group on 30 days and 90 days(P<0.05).In control group,the ɑ-SMA and TGF-β1were expressed higher than those in experimental group on 60 days and 90 days(P<0.05).Conclusion Local delivery of triamcinolone via a biodegradable stent can decrease the expression of ɑ-SMA and TGF-β1in healing process of injuried leporine bile duct,which may be potentially relieve the biliary stricture.

Triamcinolone Eluting stents Billiary tract ɑ-SMA TGF-β1

内蒙古自治区自然科学基金(编号：2013MS11124)，内蒙古自治区人民医院博士科研启动资金(编号：BS201503)

1007-4287(2017)02-0285-05

R657.4

A

宋楠，内蒙古医科大学硕士研究生(在读);王石，内蒙古自治区人民医院主任医师，硕士研究生导师，肝胆胰脾外科，擅长肝、胆、胰、脾疾病的诊断及微创治疗;谢忠士，吉林大学中日联谊医院胃肠结直肠外科，副主任医师，硕士研究生导师，擅长胃肠、结直肠疾病诊断及微创治疗。

2016-10-20)

*通讯作者