活血除痹汤对硬皮病小鼠皮肤血小板衍生生长因子A和转移生长因子-β表达的影响

潘厚儒，陈曦，张润田，徐国梅，段行武

1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029

活血除痹汤对硬皮病小鼠皮肤血小板衍生生长因子A和转移生长因子-β表达的影响

潘厚儒1，陈曦1，张润田1，徐国梅2，段行武1

1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029

目的观察活血除痹汤对硬皮病小鼠皮肤血小板衍生生长因子A（PDGF-A）和转化生长因子-β（TGF-β）表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法30只小鼠随机分为空白组、模型组和中药高、中、低剂量组，每组6只。除空白组外，其余各组小鼠均予皮内注射盐酸博来霉素0.1 mL，连续3周，建立硬皮病小鼠模型。第4～7周，空白组和模型组予等量蒸馏水灌胃，中药高、中、低剂量组分别给予活血除痹汤44.8、22.4、11.2 g/（kg·d）灌胃，每日1次。观察各组小鼠皮肤及肺组织病理学改变，HE染色测量皮肤厚度，免疫组化检测皮损组织PDGF-A、TGF-β和Ⅰ、Ⅲ型胶原（COL-Ⅰ/COL-Ⅲ）的蛋白表达。结果模型组小鼠真皮明显增厚，胶原纤维明显增粗，并有炎性细胞浸润；肺组织可见肺泡间隔增厚，有成纤维细胞形成并伴大量单核细胞浸润；与模型组比较，中药各剂量组皮肤厚度、真皮胶原纤维膨大增厚程度及肺泡间隔增粗程度均有所减轻。模型组PDGF-A、TGF-β、COL-Ⅰ及COL-Ⅲ蛋白表达均较空白组明显增加（P＜0.01）；中药各剂量组上述指标阳性表达均较模型组明显降低（P＜0.01）。PDGF-A、TGF-β表达与COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表达呈正相关。结论活血除痹汤可能通过抑制PDGF-A、TGF-β的表达，抑制胶原表达和成纤维细胞的生成，达到治疗硬皮病的作用。

硬皮病；活血除痹汤；胶原蛋白；血小板衍生生长因子A；转化生长因子-β；小鼠

硬皮病皮肤增厚、硬化与内脏纤维化与胶原纤维在细胞外基质中过度增生、沉积有关。研究表明，血小板衍生生长因子A（PDGF-A）和转化生长因子-β（TGF-β）在胶原纤维的分化、增殖及代谢中扮演重要的角色[1-2]。活血除痹汤为临床治疗硬皮病硬化期经验方，由当归四逆汤化裁而成。有研究显示，当归四逆汤对硬皮病硬化期患者疗效确切[3-4]。本实验观察其对硬皮病硬化期模型小鼠皮肤TGF-β、PDGF-A表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

雌性清洁级6周龄近交系Balb/c小鼠30只，体质量约20 g，北京维通利华实验技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于北京中医药大学东直门医院清洁级动物实验室，温度（21±3）℃，湿度25%～35%，自然光线。

1.2 药物与试剂

活血除痹汤（当归10 g，白芍10 g，丹参15 g，川芎10 g，鸡血藤30 g，桂枝10 g，杜仲10 g，黄芪15 g，秦艽15 g，防风10 g，拳参15 g，豨莶草10 g），北京中医药大学东直门医院中药房，水煎，药液浓度为4.48 g/mL；注射用盐酸博来霉素，日本化药株式会社，批号730342。

1.3 主要试剂与仪器

磷酸盐缓冲液（PBS），北京迈晨科技有限公司；PDGF-A抗体、Ⅰ型胶原（COL-Ⅰ）抗体、Ⅲ型胶原（COL-Ⅲ）抗体，武汉博士德生物技术有限公司；TGF-β抗体，英国Abcam；羊抗兔IgG/HRP试剂盒、羊抗小鼠IgG/HRP试剂盒、兔抗羊IgG/HRP试剂盒、DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。抗敏脱毛机（广州市有喜化妆品有限公司），电热恒温孵育箱（上海福玛实验设备有限公司），低温高速离心机（德国Sigma公司），显微镜（日本Olympus公司）。

2 实验方法

2.1 分组和造模

30只小鼠随机分为空白组、模型组和中药高、中、低剂量组，每组6只。实验前1 d除去所有小鼠背部中央区被毛。参照文献[5-6]方法及预实验结果，在小鼠背部脱毛区中央，空白组皮内注射10 mmol/L PBS 0.1 mL，其余各组皮内注射400 µg/μL盐酸博来霉素0.1 mL，每日1次，连续3周。

2.2 给药

中药高、中、低剂量组予44.8、22.4、11.2 g/（kg·d）活血除痹汤灌胃，空白组和模型组予等量蒸馏水灌胃。给药体积均为0.2 mL，每日1次，连续4周。

2.3 检测指标

末次给药后24 h脱颈处死小鼠，开胸切取肺叶，取皮肤约100 mg，福尔马林固定，石蜡包埋，切片。镜下观察皮肤和肺组织改变，观察皮肤厚度、胶原纤维增生情况及血管变化。

2.4 HE染色

4倍目镜下每只小鼠染色切片随机选取6个视野拍照，Image-ProPlus6.0软件测量真皮和表皮厚度，取其平均值。

2.5 免疫组化染色

组织固定，二甲苯脱蜡，100%乙醇洗去二甲苯，梯度乙醇水化，蒸馏水洗涤；抗原修复，PBS冲洗3次×2 min；内源性过氧化物酶灭活，滴加1∶100一抗100 μL孵育，4 ℃冰箱过夜，次日取出，室温复温约30 min，PBS洗5次×3～5 min；滴加二抗Ⅰ，37 ℃恒温孵育20 min，取出，PBS冲洗3次×2 min，滴加二抗Ⅱ，37 ℃恒温孵育25 min，取出，PBS冲洗3次×2 min；DAB显色，镜下观察；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下采集图像，切片随机选取10个视野。以Image-ProPlus6.0软件分析阳性区域平均光密度（IOD）值。

3 统计学方法

4 结果

4.1 活血除痹汤对模型小鼠皮肤厚度的影响

模型组皮肤厚度较空白组明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，中药各剂量组皮肤厚度明显降低（P＜0.01），高剂量组皮肤厚度降低最明显（P＜0.01）。结果见表1。

表1 各组小鼠皮肤厚度比较（±s，μm）

表1 各组小鼠皮肤厚度比较（±s，μm）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与中药高剂量组比较，△△P＜0.01

组别 只数 皮肤厚度空白组 6 31.04±1.73模型组 6 112.00±5.27**中药高剂量组 6 41.19±1.37##中药中剂量组 6 54.19±1.37##△△中药低剂量组 6 75.40±2.77##△△

4.2 活血除痹汤对模型小鼠皮损组织病理形态的影响

模型组真皮层较空白组明显增厚，胶原纤维数量增加、增粗膨大，纤维间隙变窄，毛囊萎缩，真皮血管周围和间质内有炎性细胞浸润，血管壁明显增厚，脂肪层减少甚至消失，皮肤附属器明显减少；中药各剂量组真皮厚度及胶原纤维增粗膨大异常均有不同程度减轻，血管周围炎性细胞浸润程度有所缓解，中药高剂量改变最明显。结果见图1。

图1 各组小鼠皮损组织病理形态（HE染色，×20）

4.3 活血除痹汤对模型小鼠皮肤血小板衍生生长因子A、转化生长因子β和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的影响

镜下可见小鼠皮损TGF-β特异性染色集中在毛囊周围、细胞浆和血管壁周围，模型组表皮、真皮厚度明显高于空白组，真皮组织排列紊乱；中药各剂量组皮损和真皮组织排列紊乱程度逐渐减轻。见图2。空白组小鼠皮肤PDGF-A散在于毛囊周围，呈轻度染色；模型组PDGF-A真皮层大量出现且呈强阳性反应，皮肤组织排列紊乱；中药各剂量组PDGF-A在真皮层中表达逐渐趋于空白组。见图3。模型组有大量COL-Ⅰ沉积在真皮层，胶原堆叠明显且排列紊乱；中药各剂量组COL-Ⅰ堆叠情况减轻，特异性染色转淡。见图4。COL-Ⅲ在空白组表达明显低于COL-Ⅰ，模型组可见COL-Ⅲ增生、堆叠、高度染色且排列紊乱，中药各剂量组COL-Ⅲ增生、堆叠和染色逐渐好转，见图5。模型组TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ含量较空白组明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，中药高各剂量组TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ含量明显降低（P＜0.01），中药高剂量组降低最明显（P＜0.01）。结果见表2。

图3 各组小鼠皮损组织PDGF-A蛋白表达（免疫组化染色，×20）

4.4 相关性分析

皮肤厚度与TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ呈显著正相关（P＜0.01）。

图4 各组小鼠皮损组织COL-Ⅰ蛋白表达（免疫组化染色，×20）

图5 各组小鼠皮损组织COL-Ⅲ蛋白表达（免疫组化染色，×20）

表2 各组小鼠皮损组织TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ含量比较（±s，IOD值）

表2 各组小鼠皮损组织TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ含量比较（±s，IOD值）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与中药高剂量组比较，△△P＜0.01

组别 只数 TGF-β PDGF-A空白组 6 64.78±3.97 83.82±2.00 80.36±0.85 66.79±9.84 COL-Ⅰ COL-Ⅲ模型组 6 193.44±8.12**199.40±3.35**199.22±2.68**197.61±8.89**中药高剂量 6 97.07±3.24##105.80±1.75##95.66±1.89##78.82±4.35##中药中剂量 6 144.05±8.46##△△147.60±2.72##△△120.93±1.11##△△120.99±3.03##△△中药低剂量 6 168.44±5.95##△△165.28±2.26##△△178.75±2.60##△△159.55±5.52##△△

5 讨论

硬皮病属中医“痹证”“皮痹”“虚损”范畴，一般认为其主要由于脾肺气虚，肾精不足，腠理不密，卫外不固，风寒湿邪乘虚侵袭，阻于皮肤、肌肉、筋膜之间，以致营卫不和，经络闭阻，气血凝滞，痹塞不通而成。有研究显示，中药刺山柑总生物碱可通过调节小鼠基质金属蛋白酶-9及其抑制剂-1和白细胞介素4/干扰素-γ的失衡、减少COL-Ⅳ合成，改善硬皮病组织纤维化[7-8]。本实验皮肤厚度和组织学观察结果显示，造模部位皮损符合硬皮病硬化期的病理改变。造模部位皮肤厚度随TGF-β及PDGF-A含量升高而增加，且皮肤厚度与COL-Ⅰ、COL-Ⅲ皮肤含量呈正相关。模型小鼠经活血除痹汤干预后，其皮损厚度明显变薄，胶原纤维增粗、紊乱情况有所改善；同时，皮损组织TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的含量明显降低。活血除痹汤各剂量组干预硬皮病小鼠模型均有显著效果，且高浓度作用最佳。

TGF-β是促进细胞外基质（ECM）生成的重要因子之一，是诱发硬皮病胶原增生的重要物质，并能通过分泌基质金属蛋白酶抑制物，阻止ECM的降解[9]。PDGF-A可促进成纤维细胞的增殖、活化并诱导其转分化，并具有减缓ECM降解的功能。有研究显示，硬皮病患者小毛细血管、毛囊周围及特定皮肤细胞中PDGF-A含量升高，而在正常皮肤中含量极少[10]。另外，TGF-β可使成纤维细胞对PDGF-A的敏感性增加[11]，硬皮病患者皮肤及肺组织成纤维细胞中存在TGF-β、PDGF-A与PDGF受体α（PDGFR-α）的自分泌循环通路，提示在硬皮病发展过程中PDGF-A和TGF-β存在交互作用[12]。本研究结果显示，小鼠皮肤厚度与TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的含量均呈正相关，提示活血除痹汤可能是通过抑制TGF-β和PDGF-A的含量，进而减少成纤维细胞的生成及分化、减少胶原生成、促进ECM代谢，达到治疗硬皮病的作用。

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Effects of Huoxue Chubi Decoction on PDGF-A and TGF-β Expression in Skin of Scleroderma Mice Model

PAN Hou-ru1, CHEN Xi1, ZHANG Run-tian1, XU Guo-mei2, DUAN Xing-wu1
(1. Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2. The Third Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

ObjectiveTo observe the effects of Huoxue Chubi Decoction on contents of PDGF-A and TGF-β in skin lesion of scleroderma mimicking mice models; To discuss its possible mechanism.MethodsThirty mice were randomly assigned into blank group, model group, TCM high-, medium-, low-dose group, with six mice in each group. Other than blank group, the rest of the 4 groups were given bleomycin-hydrocholoride 0.1 mL intradermal injection daily for 3 weeks to establish scleroderma mice models. From week 4 to 7, blank group and model group received gavage with equal amount of distilled water daily; TCM high-, medium-, low dosage group received gavage with Huoxue Chubi Decoction with different concentrations of 44.8, 22.4, 11.2 g/kg daily. The pathological changes in the skin tissue samples taken from each group were observed under microscope; the thickness of skin from each group was measured and the expression of PDGF-A, TGF-β, type-Ⅰ collagen (COL-Ⅰ) and type-Ⅲ collagen (COL-Ⅲ) were tested through immunohistochemical staining.ResultsCompare with blank group, the dermis tissue of model group was thicker, with the presence of thicker and greater number of collagen fibers, as well as infiltration of inflammatory cells. Compare with model group, thickness of skin and dermis collagen growth of TCM high-, medium-, low-dose group were milder varied by the concentration of the decoction. The result of immunohistochemical staining showed that the expressions of PDGF-A, TGF-β, COL-Ⅰ and COL-Ⅲ of modelgroup significantly increased than blank group (P＜0.01); the expression of the mentioned indicators were statistically significant lower in the TCM high-, medium-, low-dose group than model group; The expressions of PDGF-A and TGF-β showed a positive correlation with the amount of COL-Ⅰ and COL-Ⅲpresented in each group.ConclusionHuoxue Chubi Decoction can suppress collagen expression and fibroblast formation in skin lesion of scleroderma mice models by down regulating the expressions of TGF-β and PDGF-A, thus demonstrate its potential in scleroderma treatment.

scleroderma; Huoxue Chubi Decoction; collagen; platelet-derived growth factor A; TGF-β; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.012

R285.5

A

1005-5304(2017)03-0048-05

2016-04-02）

（

2016-05-12；编辑：华强）

北京中医药大学自主选题项目（2013-JYBZZ-XS-189）

段行武，E-mail：xwduan@sina.com