微球体培养富集肿瘤干细胞及其潜在的临床应用*

2017-03-03付欣王珂

中国肿瘤临床 2017年3期

付欣王珂

·国家基金研究进展综述·

付欣王珂

肿瘤干细胞假说是近年来提出的关于肿瘤的新理论，该理论认为肿瘤干细胞在肿瘤发生、发展和转移等过程中起着决定性的作用，肿瘤干细胞理论的提出给肿瘤治疗提供了新的思路和策略。但是，肿瘤中只有一小部分细胞为肿瘤干细胞，因此鉴定并富集这些细胞以进一步研究是众多科研人员面临的巨大挑战。微球体培养技术是近年发展起来的一种有效富集肿瘤干细胞的技术，该技术的应用使肿瘤干细胞的研究变得更加容易，并使临床应用这些细胞来评价肿瘤进展及患者预后成为可能，本文将对该技术及其与微系统的整合进行详细的阐述。

肿瘤干细胞微球体培养生物标记微系统

肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）假说认为在异质性的肿瘤中只有一小部分细胞具有干细胞的特性，可促进肿瘤生长，并对放化疗有着更强的耐受性［1］。传统的肿瘤治疗方法只清除了大多数的癌细胞，但是CSC仍然存在，而这一小部分细胞正是肿瘤转移和复发的潜能细胞［2］，所以更好地理解CSC的分子及细胞生理学，并发展可用于临床的CSC病理诊断方法将是帮助患者消除肿瘤的关键。然而，目前的活检技术只是分析大多数细胞群的分子标志，但少数的CSC则不能被检出，因此如何富集这些细胞来做进一步的研究将是众多科研人员面临的巨大挑战。随着科研人员对肿瘤干细胞的研究，微球体培养技术应运而生，该技术是近年发展起来的一种有效富集肿瘤干细胞的技术。目前科研人员应用微球体培养技术已经在淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、口腔鳞癌等多种肿瘤中成功分离出CSC［3-6］，说明无论是贴壁生长的细胞还是悬浮培养的细胞均可以利用该技术分离CSC。但是通过查阅大量文献发现，每个实验室对于微球体培养技术的理解和应用该技术分离干细胞的具体操作方法不尽相同，而且不同癌种分离干细胞所需要的器皿类型和培养基种类也略有差异［6-7］。更好地理解并利用该技术，对CSC的研究和肿瘤的治疗有重要意义。本文将就微球体培养技术及其应用，以及与微系统的整合进行详细介绍。

1 微球体培养技术

1.1 富集CSC的常用方法

目前富集CSC常用的方法有荧光激活细胞分离技术（fluorescence activated cell sorting，FACS）、侧群干细胞检测技术、特异蛋白标志物分选技术以及微球体培养技术。FACS的工作原理是将细胞与特异的荧光标记抗体孵育，利用FACS系统将被标记的细胞分选出来。从原理上来说，FACS分选CSC对于肿瘤的诊断和预后是一个较好的选择，但FACS对于样品的制备非常繁琐并且需要有经验的工作人员操作，而且FACS需要大量的细胞，因此会损失很多样品；另外由于CSC表型并非一成不变，所以FACS的推广实施存在很多技术难题［8］。侧群干细胞检测技术的工作原理是利用CSC强大的细胞膜泵功能，将细胞进行Hoechst 33342或罗丹明123染色，由于CSC能够将染料排出，从而根据细胞内是否有荧光染料将细胞进行分选，但是该技术对设备和技术要求较高，一般实验室难以实施，另外染料本身具有一定的细胞毒性，而且样本制备过程较为复杂，导致干细胞活性降低［9］。另外，细胞还可以通过CSC表面的特异蛋白标志来分选［10-12］，但是该方法同样面临标志蛋白特异性的问题。所以以上方法的实施均受到各方面的限制，因此需要一个更有效的富集CSC的技术。

1.2 微球体培养技术原理及优缺点

早期研究肿瘤干细胞的实验为探索富集CSC的新方法提供了一定的线索，在低黏附板中利用含EGF的无血清培养液培养神经细胞，结果选择性地形成了悬浮的多潜能克隆球，这些克隆球被称为神经球。随后研究人员从脑肿瘤样本中获得的细胞，利用相似的培养条件培养后也获得了神经球，证明该技术可以用于富集CSC［13］。微球体培养技术是根据肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞的生长特性不同发展而来的，普通肿瘤细胞对培养基中的血清及贴壁培养要求较高，而肿瘤干细胞对生长因子依赖性强，将细胞悬浮培养在含有生长因子的无血清的培养基中，其中只有具有自我更新能力的干细胞可以增殖并形成致密的细胞球，而非干细胞因不具备自我更新能力而逐渐死亡。目前，微球体培养干细胞技术已经成为研究CSC的一种普遍方法。由于微球体培养技术是通过细胞间不同生长特性而分选培养的，无需对细胞进行染色标记等处理，因此对细胞的活性几乎无影响，并且对设备的要求较低。但微球体培养技术与常规的肿瘤细胞培养不同，每个实验室对于微球体培养技术的理解和应用该技术分离干细胞的具体操作方法不尽相同，而且不同癌种分离干细胞所需要的器皿类型和培养基种类也略有差异，因此单一的培养条件并不适用于所有的肿瘤干细胞克隆球的分选与培养，对不同的肿瘤干细胞需要逐个进行培养条件的探究。

1.3 微球体培养技术的操作要点

由于血清可以促进细胞分化，所以微球体培养利用无血清的干性培养基，同时要保证细胞生长，故在干性培养基中添加细胞生长因子。常用的干性培养基有神经基础培养基和DMEM/F12等，生长因子有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍化生长因子等，有些干细胞培养还要添加B27、胰岛素等，细胞不同所添加的试剂不同，所以需要对每种干细胞的最佳培养条件进行摸索。统计部分肿瘤干细胞成球培养所需的生长因子及浓度，EGF和b-FGF是必须的，但其浓度在不同的肿瘤干细胞培养中也不尽相同（表1）。另外，有些肿瘤具有自分泌细胞生长因子的功能，所以在不添加生长因子的干性培养基中依然可以成球［14］。细胞贴壁可以促进细胞分化，所以干细胞成球培养需要非黏附培养皿，超低密度培养可以保证CSC球来源于一个单克隆细胞，通常铺种细胞的密度＜1×10/μL［20］。

1.4 微球体的传代与冻存

干细胞传代理论上与普通细胞传代一样，可以无限传代，并保持干细胞特性。但有研究发现，长期悬浮培养的乳腺干细胞随着代数增加，细胞球逐渐减少、形成比率减小，分化为肌上皮的细胞数逐渐增多，而且细胞出现衰老现象［21］，提示随着传代干细胞特性逐渐缺失。CSC在培养过程中保持干性传代的数目尚无定论，不同种类的干细胞可能保持干性的代数不同，这就需要在传代过程中注意细胞的分化，必要时检测细胞干性标志物，而且在实验过程中尽量减少传代次数。另外，有研究发现不同的消化干细胞球的方法对维持细胞的干性有着显著的影响，程春凤等［22］比较了四种消化方法对神经干细胞干性的影响，发现单纯的0.02%EDTA可以较好的维持细胞干性，且对细胞的后续损伤相对较小。

表1 不同的肿瘤干细胞相对应的生长因子和浓度Table 1 The corresponding growth factor and concentration of different tumor stem cells

目前对于干细胞如何更好地冻存，不同的实验室采用不同的方法［23-25］，以微球体的形式冻存还是以单细胞悬液的形式冻存也尚无定论。Mao等［26］将微球体消化呈单细胞悬液进行冻存，检测了细胞冻存前后细胞的活性、增殖能力、成球能力、成瘤能力，发现单细胞悬液冻存可以很好的维持干细胞特性。另有研究认为干细胞若以球体形式冻存，冻存液中的营养成分难以到达球体中心，从而影响细胞的活性，所以认为干细胞冻存以单细胞形式较好［27］。此外，各实验室配制冻存液的成分也不尽相同，由于血清可以促进干细胞分化，所以为避免细胞分化在冻存液中不需要添加血清。另外，关于冻存液中DMSO比例问题，有研究表明10%的DMSO冻存干细胞能更好的保持细胞干性，而且复苏的细胞存活更好［23，28］。

2 微球体培养技术的应用

2.1 微球体培养技术鉴定并富集CSC

动物体内原位移植法是鉴定CSC的主要方法，具体操作方法是首先利用表面标志物分选细胞亚群，再将这些亚群按不同细胞梯度接种到免疫缺陷小鼠体内，再比较这些亚群的成瘤能力，从而筛选出干细胞的优势标志物，但是这种方法耗时较长。而微球体培养技术相对简单，耗时短。利用微球体培养技术，已经成功分离了多种干细胞，如神经干细胞、胶质瘤的干细胞、结直肠癌的干细胞等等［1，5，16］。Dontu等［29］首次证明了无血清非黏附的培养条件可富集人乳腺上皮细胞中的乳腺干细胞。既然通过微球体培养技术可富集乳腺组织中的干细胞，该技术发现后证实乳腺癌细胞也可以形成微球体。Ponti等［30］利用该技术在乳腺肿瘤组织及MCF-7细胞系中均培养出乳腺微球体。从乳腺微球体中获得的细胞具有与干细胞相同的蛋白表达模式，并且注射1 000个MCF-7微球体细胞于小鼠乳腺脂肪垫，就可以起始肿瘤形成，而普通的MCF-7细胞起始肿瘤则需要100万个。后期Shaw等［31］的研究也得到相似的结果。随后在黑色素瘤、前列腺癌及胶质瘤利用微球体均富集了CS。

2.2 微球体培养技术可发现生物标记并协助治疗

目前，许多实验室应用微球体技术鉴定出了CSC的特异生物标记，并以此为临床肿瘤患者提供一个更全面的诊断。Ponti等［30］利用人乳腺癌组织进行微球体培养，发现形成微球体的细胞上皮细胞分子标记低表达，而这些细胞分化后上皮标记蛋白表达水平又恢复，该研究同时证实乳腺癌CSC表型是CD44+/ CD24-。另外一个关于CSC生物标记的重要研究显示，形成微球体的乳腺癌细胞呈ALDH阳性，而AL⁃ DH阴性的细胞均不能形成微球体［32］。因此，ALDH也可以作为CSCs的一个标记。同样，利用低黏附培养条件下的微球体形成技术，Tirino等［33］发现CD133是非小细胞肺癌CSCs的一个重要生物标记。

许多科研小组利用微球体技术来研究维持CSC表型相关的信号通路，这些通路可以作为CSCs的标志以及潜在的药物靶点。Hedgehog信号通路在维持干细胞的自我更新和增殖中具有重要作用。有研究发现细胞因子IL-8可增强乳腺癌细胞系的成球能力，因此证实IL-8与维持CSC表型相关［34］。Fillmore等［35］发现雌激素刺激可以增强MCF-7的微球体形成能力，进一步研究证实雌激素通过FGF/FGFR/Tbx3信号通路增加了CSCs的数目。Msi1（Musashi1）是Notch和Wnt通路中一个重要调节因子，研究发现Msi1与乳腺癌细胞系的微球体形成能力相关，Msi1敲除后微球体形成能力减弱，所以认为Msi1是CSCs的一个标识，这也许可以成为一个新的药物靶点。另外，有研究利用微球体培养技术发现异位表达Oct4和Nanog增强了肺癌细胞系的成球能力、耐药性以及发生EMT的趋势［36-37］。

微球体分析同样应用于对CSCs有效的药物筛选。微球体技术证实许多常用的化疗药物，包括阿霉素、紫杉醇等，均对CSCs无效［38］。该研究通过对多种化学药物筛选发现盐霉素可能是对CSCs有效的药物，因为与紫杉醇相比，盐霉素明显减弱了乳腺癌细胞形成微球体的能力。Bandyopadhyay等［39］利用微球体技术证实阿霉素对CSCs无效，但是阿霉素联合TGF-β1抑制剂对CSCs有效。另一项关于潜在药物的研究发现，萝卜硫素可以抑制乳腺癌细胞系的微球体形成［40］，利喘贝能够减弱MDA-MB-231的微球体形成［41］。总之，对于信号通路上潜在靶点的研究以及潜在药物的筛选鉴定，都证明微球体分析技术是一种非常有用的工具。

2.3 微球体培养技术的潜在临床应用

微球体培养富集CSC的技术已经在科研领域广泛应用，由于利用乳腺癌组织及胸膜渗出液中的细胞来进行微球体培养是可行的，因此认为在临床上可应用该技术从患者的活检组织中来富集、鉴定及进一步研究CSC。目前，对于患者的治疗方法及预后评估大多通过某些生物标记蛋白的组织染色来确定，但是引起肿瘤耐药、转移及复发的只是占肿瘤一小部分的CSC，所以对于肿瘤耐药及转移的评估，CSC就显得非常重要［42］。因此，与传统的评估方法相比，从肿瘤组织中富集CSCs应用于临床分析将有更大的临床意义。

目前临床上有两个渠道可以获取CSC，一是从原发肿瘤的活检组织中获取CSC，二是从患者血液中获得具有转移潜能的CSC［43］。在获得肿瘤组织样本后，去除脂肪、血液等组分，将收集的细胞在微球体培养条件下培养，5～7天后细胞中CSCs会形成微球体，而其他分化细胞则死亡。通过对细胞的病理学分析评估患者的预后及治疗方案。可以对构成微球体的细胞进行生物标记的检测，从而提示转移的可能性及对药物的敏感程度。另外，可以利用富集的CSC进行药物筛选，从而直接确定药物的作用效果。与单独的病理诊断结果相比，以上这些检测方法有利于为患者提供更有效的治疗方案。

3 微系统使微球体培养技术的临床应用成为可能

理论上CSC的相关检测看似具有非常乐观的应用前景，但目前在临床上却并不实用。现阶段在96孔板上培养微球体以及富集CSC需要许多严格繁琐的步骤。因为相对较少的细胞数量以及微球体的非贴壁生长，对于细胞的收集分析非常的困难。因此这种劳动密集型的过程对于临床应用并不合适。所以将微球体技术融入到整合的微系统中是目前该技术作为诊断工具的关键。微系统可以通过无缝隙集成多种功能来增加自动化及处理能力，避免繁琐的人工操作。像数量较少的悬浮细胞这类比较难处理的样品，微系统就显得尤为方便。Sung等［44］发明了模拟组织及肿瘤组成的3D培养系统，以便在更合适的微环境条件下研究肿瘤。Hsiao等［45］利用共培养前列腺癌细胞与内皮及成骨细胞代表转移肿瘤，从而更好地模拟肿瘤微环境。尽管这些技术大都应用于实验研究，但是如果细胞培养微系统能够更容易操作，其临床应用潜能较大。

在整合的微系统中实现微球体分析可以突破仅在微球体培养板中分析CSC的局限。首先，一个全面的CSC分析包括细胞复苏、培养、药筛及分子分析，这些步骤在微球体培养板中无法进行人工操作，而一个整合的微系统可以将这些集中在一个单独的装置中，使对少量细胞的处理不需要人工操作。其次，在培养板中清洗悬浮的细胞是很难做到的，而微系统可以将细胞固定在特定的位置从而进行换液清洗。另外，在培养板中培养的悬浮细胞随意的漂浮并易于聚集，而在微系统中细胞培养表面被微结构化，细胞就像被困在微孔中，因此可以阻止细胞在培养环境中任意的漂动聚集，从而实现了目前微球体培养无法做到的对单细胞的长期观察。

4 展望

鉴别并分析原发肿瘤及循环中的CSC是评估肿瘤复发及转移的关键，同样也是为肿瘤患者制定最有效治疗方案的关键。从异质性细胞群中鉴别分离特异细胞的传统方法依赖于FACS，然而，该方法并不适合分离数量较少的细胞，同时由于复杂的操作使FACS在CSC方面的分析很难应用于临床。在肿瘤生物研究领域，微球体技术成为愈来愈受欢迎的一种分离富集CSC的方法，微球体培养介质及低黏附培养板的商业化，使该技术能更好地应用于研究。但是微球体培养及后续的CSC分析需要大量人力参与，并不适合在临床系统中应用。微系统的利用使微球体技术在临床利用成为可能，该系统装配并不昂贵并且易于操作，重要的是其可以整合一些附加的功能，包括样品准备及分子分析，因此可以代替大量的人力资源。也正是因为自动化，微球体微系统具有能够在临床系统中应用的潜能，从而使未来肿瘤的诊断及治疗方法更加完善。

[1]Lawson DA,Bhakta NR,Kessenbrock K,et al.Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells [J].Nature,2015,526(7571):131-135.

[2]Gilbertson RJ,Graham TA.Cancer:Resolving the stem-cell debate [J].Nature,2012,488(7412):462-463.

[3]Li YJ,Guo Y,Wu SL,et al.Human nasopharyngeal cancer stem cell microspheres:Culture and biological characterization[J].Med Postgra, 2014,27(11):1133-1138.[李亚军,郭颖,吴顺龙,等.人鼻咽癌干细胞微球体培养并鉴定其生物特性[J].医学研究生学报,2014,27(11): 1133-1138.]

[4]Wang SS,James Yin,Zhang HJ,et al.Construction and Identifi cation a Culture Method of Non-adherentMicrospheres for Human T-cell Lymphoma Stem Cells[J].Chinese Journal of Cell Biology,2014, 36(8):1133-1141.[王珊珊,殷勤伟,张洪杰,等.非贴壁微球体培养法分离T-淋巴细胞瘤干细胞及鉴定[J].中国细胞生物学学报, 2014,36(8):1133-1141.]

[5]Zhang HL,Zhang FC,Wang P,et al.Establishment of colorectal cancer stem cell-derived tumorspheres and its multi-drug resistance [J].Tumor,2016,36(2):140-148.[张欢乐,张凤春,王萍,等.结直肠癌干细胞微球体的培养及耐药机制[J].肿瘤,2016,36(2):140-148.]

[6]Zhang SQ,Zhang B,Hong L,et al.Identification and differentiation of breast cancer stem cells under tumor microenvironment[J],Chinese Journal of Tissue Engineering Research,2015,19(14):2155-2160.[张书卿,张博,洪亮,等.乳腺癌干细胞培养鉴定及分化过程中微环境的影响[J].中国组织工程研究,2015,19(14):2155-2160.]

[7]Huang MZ,Zhang FC,Zhang YY.Influence factorson the formation of mammo spheres from breast cancer stem cells[J].Journal of Peking University(Health Sciences),2008,40(5):500-504.[黄明主,张凤春,张雁云.乳腺癌干细胞微球体形成的影响因素[J].北京大学学报(医学版),2008,40(5):500-504.]

[8]von Recum-Knepper J,Sadewasser A,Weinheimer VK,et al.Fluorescence-activated cell sorting-based analysis reveals an asymmet-ric induction of interferon-stimulated genes in response to seasonal influenza a virus[J].J Virol,2015,89(14):6982-6993.

[9]Yang Y,Fan Y,Qi Y,et al.Side population cells separated from A549 lung cancer cell line possess cancer stem cell-like properties and inhibition of autophagy potentiates the cytotoxic effect of cisplatin [J].Oncol Rep,2015,34(2):929-935.

[10]Liu H,Wang YJ,Bian L,et al.CD44+/CD24+cervical cancer cells resist radiotherapy and exhibit properties of cancer stem cells[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(9):1745-1754.

[11]Nosrati A,Naghshvar F,Maleki I,et al.Cancer stem cells CD133 and CD24 in colorectal cancers in Northern Iran[J].Gastroenterol Hepatol Bed Bench,2016,9(2):132-139.

[12]Margaritescu C,Pirici D,Cherciu I,et al.CD133/CD166/Ki-67 triple immunofluorescence assessment for putative cancer stem cells in colon carcinoma[J].J Gastrointestin Liver Dis,2014,23(2):161-170.

[13]Yip S,Sabetrasekh R,Sidman RL,et al.Neural stem cells as novel cancer therapeutic vehicles[J].Eur J Cancer,2006,42(9):1298-1308.

[14]Chiron D,Maiga S,Surget S,et al.Autocrine insulin-like growth factor 1 and stem cell factor but not interleukin 6 support self-renewal of human myeloma cells[J].Blood Cancer J,2013,3:e120.

[15]Cao L,Zhou Y,Zhai B,et al.Sphere-forming cell subpopulations with cancer stem cell properties in human hepatoma cell lines[J].BMC Gastroenterol,2011,11:71.

[16]Kelly JJ,Stechishin O,Chojnacki A,et al.Proliferation of human glioblastoma stem cells occurs independently of exogenous mitogens [J].Stem Cells,2009,27(8):1722-1733.

[17]Tomellini E,Touil Y,Lagadec C,et al.Nerve growth factor and proNGF simultaneously promote symmetric self-renewal,quiescence,and epithelial to mesenchymal transition to enlarge the breast cancer stem cell compartment[J].Stem Cells,2015,33(2):342-353.

[18]Sette G,Salvati V,Mottolese M,et al.Tyr1068-phosphorylated epidermal growth factor receptor(EGFR)predicts cancer stem cell targeting by erlotinib in preclinical models of wild-type EGFR lung cancer[J].Cell Death Dis,2015,6:e1850.

[19]Yoon C,Park DJ,Schmidt B,et al.CD44 expression denotes a subpopulation of gastric cancer cells in which Hedgehog signaling promotes chemotherapy resistance[J].Clin Cancer Res,2014,20(15): 3974-3988.

[20]Zhai PP,Cao L,Yin ZF.Application of non-adhesive spherocytes in tumor stem cell research[J].Journal of Practical Oncology,2012,27 (5):558-561.[翟蓓蓓,曹璐,殷正丰.非黏附性球培养在肿瘤干细胞研究中的应用现状[J].实用肿瘤杂志,2012,27(5):558-561.]

[21]Dong Q,Gao H,Shi Y,et al.Aging is associated with an expansion of CD49fhi mammary stem cells that show a decline in function and increased transformation potential[J].Aging(Albany NY),2016,8 (11):2754-2776.

[22]Cheng FC,Yang Z,Li Z,et al.Compare the ef fect of four kinds of digestion methods to the prol iferation and activity of the neural stem cel l passage[J].HEILONGJIANG MEDICINE AND PHARM ACY, 2012,35(2):1-2.[程春凤,杨智,李壮,等.比较四种消化方法对神经干细胞传代增殖及活性的影响[J].黑龙江医药科学,2012,35 (2):1-2.]

[23]Maia L,Dias MC,de Moraes CN,et al.Conditioned medium:A new alternative for cryopreservation of equine umbilical cord mesenchymal stem cells[J].Cell Biol Int,2016[Epub ahead of print].

[24]Csobonyeiova M,Krajciova L,Nicodemou A,et al.Induction of pluripotency in long-term cryopreserved human neonatal fibroblasts in feeder-free condition[J].2016[Epub ahead of print].

[25]Merlo B,Pirondi S,Iacono E,et al.Viability,in vitro differentiation and molecular characterization of equine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells cryopreserved in serum and serum-free medium[J].Cryo Letters,2016,37(4):243-252.

[26]Mao XG,Guo G,Wang P,et al.Maintenance of critical properties of brain tumor stem-like cells after cryopreservation[J].Cell Mol Neurobiol,2010,30(5):775-786.

[27]Tan FC,Lee KH,Gouk SS,et al.Optimization of cryopreservation of stem cells cultured as neurospheres:comparison between vitrification,slow-cooling and rapid cooling freezing protocols[J].Cryo Letters,2007,28(6):445-460.

[28]Hoffman RM,Kajiura S,Cao W,et al.Cryopreservation of hair-follicle associated pluripotent(HAP)Stem cells maintains differentiation and hair-growth potential[J].Adv Exp Med Biol,2016,951:191-198.

[29]Dontu G,Al-Hajj M,Abdallah WM,et al.Stem cells in normal breast development and breast cancer[J].Cell Prolif,2003,36(Suppl 1):59-72.

[30]Ponti D,Costa A,Zaffaroni N,et al.Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties[J].Cancer Res,2005,65(13):5506-5511.

[31]Shaw FL,Harrison H,Spence K,et al.A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2012,17(2):111-117.

[32]Ginestier C,Hur MH,Charafe-Jauffret E,et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome[J].Cell Stem Cell,2007,1(5):555-567.

[33]Tirino V,Camerlingo R,Franco R,et al.The role of CD133 in the identification and characterisation of tumour-initiating cells in nonsmall-cell lung cancer[J].Eur J Cardiothorac Surg,2009,36(3):446-453.

[34]Charafe-Jauffret E,Ginestier C,Iovino F,et al.Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature[J].Cancer Res,2009,69(4):1302-1313.

[35]Fillmore CM,Gupta PB,Rudnick JA,et al.Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(50):21737-21742.

[36]Chiou SH,Wang ML,Chou YT,et al.Coexpression of Oct4 and Nanog enhances malignancy in lung adenocarcinoma by inducing cancer stem cell-like properties and epithelial-mesenchymal transdifferentiation[J].Cancer Res,2010,70(24):10433-10444.

[37]Franqui-Machin R,Wendlandt EB,Janz S,et al.Cancer stem cells are the cause of drug resistance in multiple myeloma:fact or fiction?[J].Oncotarget,2015,6(38):40496-40506.

[38]Gupta PB,Onder TT,Jiang G,et al.Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening[J].Cell, 2009,138(4):645-659.

[39]Bandyopadhyay A,Wang L,Agyin J,et al.Doxorubicin in combination with a small TGFbeta inhibitor:a potential novel therapy for metastaticbreast cancer in mouse models[J].PLoS One,2010,5(4):e10365.

[40]Penot G,Le Peron C,Merot Y,et al.The human estrogen receptoralpha isoform hERalpha46 antagonizes the proliferative influence of hERalpha66 in MCF7 breast cancer cells[J].Endocrinology,2005, 146(12):5474-5484.

[41]Prud'homme GJ,Glinka Y,Toulina A,et al.Breast cancer stem-like cells are inhibited by a non-toxic aryl hydrocarbon receptor agonist [J].PLoS One,2010,5(11):e13831.

[42]Drouot E,Piret J,Lebel MH,et al.Characterization of multiple cytomegalovirus drug resistance mutations detected in a hematopoietic stem cell transplant recipient by recombinant phenotyping[J].J Clin Microbiol,2014,52(11):4043-4046.

[43]Lawson DA,Bhakta R,Kessenbrock K,et al.Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells [J].Nature,2015,526(7571):131-135.

[44]Sung JH,Shuler ML.A micro cell culture analog(microCCA)with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs[J].Lab Chip,2009,9(10):1385-1394.

[45]Hsiao AY,Torisawa YS,Tung YC,et al.Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids[J].Biomaterials, 2009,30(16):3020-3027.

（2016-08-12收稿）（2016-12-07修回）（编辑：周晓颖校对：张）

Micro-sphere culture gathers cancer stem cell and its potential clinical application

Xin FU,Ke WANG

Correspondence to:Ke WANG;E-mail:kewang_tj@163.com

Department of Gynecological Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81301895)

Cancer stem cell hypothesis has become a new theory.According to this theory,cancer stem cells play a decisive role in carcinogenesis,progression,and metastasis.This theory offered new ideas and strategies for cancer treatment.However,only a small fraction of cells in a tumor were cancer stem cells.Therefore,the identification and enrichment of these cells are significant challenges for numerous researchers conducting further study.Micro-sphere culture has been an effective tumor stem cell enrichment technology in recent years.The application of this technique makes the cancer stem cell research process easy.In addition,it makes the evaluation of tumor progression and prognosis of patients in clinical possible.This article will focus on the applications of this technology, and microsystem integration will be described in detail.

cancer stem cell,micro-sphere culture,biomarker,microsystem