重组溶瘤单纯疱疹病毒oHSV2治疗结直肠癌的实验研究*

2017-03-03尹磊孙燕来赵春红李增军甄亚男肖瑞雪徐忠法

中国肿瘤临床 2017年3期

尹磊孙燕来赵春红李增军甄亚男肖瑞雪徐忠法

·基础研究·

尹磊①②③孙燕来②赵春红③李增军②甄亚男③肖瑞雪③徐忠法③

目的：评估重组溶瘤单纯疱疹病毒oHSV2在CT26结肠癌荷瘤小鼠中的抗肿瘤效果，初步探讨其治疗机制。方法：构建CT26细胞荷瘤小鼠肿瘤模型。1）小鼠瘤内注射oHSV2，ELISA法测定血清中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macro⁃phage colony-stimulating factor，GM-CSF）浓度；2）荷瘤小鼠分为oHSV2组、5-氟尿嘧啶（5-FU）组（阳性对照组）、磷酸盐缓冲液（PBS）组（阴性对照组）。给药后，记录小鼠体质量、肿瘤体积、生存期及生活状态等变化，评估病毒抗肿瘤效果；3）流式细胞术定量检测肿瘤引流淋巴结（tumor-draining lymphnode，TDLN）内树突状细胞（dendritic cell，DC）及瘤体内CD4+T与CD8+T的比例。结果：1）瘤内注射oHSV2后，血清中的GM-CSF浓度不断升高。首次给药后第8天出现高峰（3150±327.1）pg/mL，后缓慢下降；2）相比PBS组，oHSV2和5-FU组均表现出显著的抗肿瘤效果，小鼠生存期显著延长（50 d vs.36 d，P＜0.01；51 d vs.36 d，P＜0.01），但oHSV2治疗未引起小鼠体质量下降。治疗起始第28天，5-FU组平均体质量较PBS组有显著性差异（16.61 g vs.22.07 g，P＜0.01），oHSV2组与PBS组差异无统计学意义（P＞0.05），且小鼠病毒注射区皮肤无坏死、溃疡；3）流式分析结果显示相比PBS组，oHSV2治疗组的DC（6.49%vs.3.73%，P＜0.01），CD4+T（15%vs.8.57%，P＜0.01）与CD8+T（8.19%vs.5.15%，P＜0.01）比例升高。而5-FU组各细胞比例较PBS组明显降低（P＜0.05）。结论：瘤内注射oHSV2有效抑制结直肠癌细胞生长，病毒治疗与化疗药物相比不伴有明显的毒副反应。病毒在荷瘤小鼠体内复制产生具有生物活性的GM-CSF，可增强抗肿瘤免疫。

结直肠癌溶瘤病毒粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子免疫治疗

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见消化道恶性肿瘤之一，其发病率不断上升［1］。结直肠癌患者有远处转移者5年生存率仅12%［2］，且超过20%的患者在确诊时已经发生远处转移［3］，死亡率居所有肿瘤的第4位［4］。目前，结直肠癌的治疗策略主要包括手术、放化疗及靶向治疗，但治疗效果均一般［5-6］。因此，结直肠癌治疗策略需要开展新的方案。

近年来，肿瘤生物疗法不断发展成熟。2015年10月，美国食品药品监督管理局（FDA）正式批准溶瘤Ⅰ型单纯疱疹病毒T-VEC治疗黑色素瘤［7］。与传统肿瘤治疗方法不同，溶瘤病毒（oncolytic viruses，OVs）是天然或经人工改造的能特异杀伤肿瘤细胞的一类病毒。目前研究表明，Ⅱ型单纯疱疹病毒其优势为：1）病毒基因内有一区域可活化Ras/MEK/MAPK通路，为病毒有效复制所必需的［8］；2）病毒分泌G糖蛋白和病毒宿主关闭蛋白，参与逃避宿主免疫，提高病毒的复制效率［9］；3）病毒可使被感染的肿瘤细胞形成合胞体（syncytia），增强抗肿瘤免疫［10］；4）被改造的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒FusOn-H2可感染杀伤多种肿瘤细胞并能诱导产生肿瘤特异性的细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）［11］；5）较Ⅰ型单纯疱疹溶瘤病毒，Ⅱ型可在很低的感染复数下杀伤癌细胞，使病毒治疗更为安全。

oHSV2删除HSV-2中的ICP34.5和ICP47基因，并插入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）基因。删除ICP34.5基因使病毒选择性地在肿瘤细胞内复制和消除病毒的致病性［12］。删除ICP47基因可促进肿瘤抗原递呈和提高病毒的选择性杀伤作用［13］。GM-CSF能招募和活化抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）［14］，诱导产生特异性的CTL杀伤肿瘤细胞。本研究首次评估oHSV2在结直肠癌荷瘤小鼠中的抗肿瘤效果，并探讨可能涉及的抑瘤机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 构建重组Ⅱ型单纯疱疹溶瘤病毒 oHSV2由湖北科技学院刘滨磊教授构建［15］，由武汉滨会生物科技股份有限公司生产提供。

1.1.2 细胞和试剂 BALB/c小鼠结肠癌细胞系CT26购自中国科学院上海细胞库。RPM 1640培养基购自Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；5氟尿嘧啶（5-FU）购自Medchem Express®公司；GM-CSF ELISA检测试剂盒购自美国R＆amp;D System公司；脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DnaseⅠ）购自美国Sigma公司，Ⅰ型胶原酶（Collagenase，type 1）购自上海Cisbio公司；各种流式用荧光素标记的小鼠单抗CD3-PE-cy5、CD4-FITC、CD8-PE、CD11c-FITC、CD86-PE及其同型对照均购自美国eBioscience公司。

1.1.3 细胞培养 CT26细胞用含有10%小牛血清的RPM 1640培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养液中加1%青链双抗，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及模型建立 5周龄雌性BALB/c小鼠（SPF级）购自山东省实验动物中心（动物合格证号：SCXK20140007）。所有动物实验均符合山东大学附属山东省肿瘤医院实验动物伦理委员会章程并获得委员会批准。取对数生长期CT26细胞，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化制备成单细胞悬液，无血清RPM 1640调整细胞密度5×106/mL，取100 μL注射于小鼠右侧背部皮下，观察肿瘤的生长情况。约1周后肿瘤直径达5～6 mm时，即可将荷瘤小鼠随机分组。

1.2.2 oHSV2在小鼠模型中表达GM-CSF的检测 12只BALB/c小鼠按上述方法荷瘤后，随机分为oHSV2组（6只）和磷酸盐缓冲液（PBS）组（阴性对照组6只）。oHSV2瘤内注射（通过一个注射点多部位给药），每次剂量为1×106pfu/100 μL，于第0、2、4、6天给药（以分组及第一次治疗为起始）。阴性对照组瘤内注射PBS，剂量100 μL，注射次数与oHSV2相同。首次给药后的第2、4、6、8、10、15、20天行小鼠眶静脉采血，血样本以4 000 r/min、离心5 min，取血清，用GM-CSF ELISA检测试剂盒测定血清中GM-CSF含量（pg/mL）。

1.2.3 oHSV2治疗荷瘤小鼠的疗效观察 45只BALB/c小鼠按上述方法荷瘤后，随机分为oHSV2组（15只）、5-FU组（15只）、PBS组（15只）。oHSV2、PBS注射方法及剂量同上。5-FU剂量75 mg/kg，腹腔注射，于第0、6天给药。每隔4 d测量小鼠肿瘤体积及小鼠体质量。观察小鼠生活状态及注射部位皮肤有无坏死。肿瘤体积（mm3）=（长×宽2）/2。小鼠生存期观察至首次给药后第60天。

1.2.4 oHSV2治疗对荷瘤小鼠免疫影响在首次给药后第10天，从上述3组小鼠中随机抽出9只荷瘤小鼠（每组3只）行肿瘤引流淋巴结（tumor-draining lym⁃phnode，TDLN）内树突状细胞（dendritic cell，DC）和瘤体内CD4+T与CD8+T比例检测。各组荷瘤小鼠处死后，分离TDLN，用300目筛网分组研磨制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/mL，各取100 μL加入流式管，然后加入荧光素标记抗体CD11c-FITC、CD86-PE室温避光孵育30 min，细胞染色缓冲液洗涤2次，BD流式细胞仪上机检测［16］。调整细胞浓度为1×107/mL，各取100 μL加入流式管，然后加入荧光素标记抗体CD3-PE-cy5、CD4-FITC、CD8-PE，室温避光孵育30 min，细胞染色缓冲液洗涤2次，BD流式细胞仪上机检测。每种抗体均设有同型对照以消除抗体非特异性结合。所有样本结果用FlowJo软件分析。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。定量数据结果均以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。采用Kaplan-Meier法及Log rank检验比较不同治疗组荷瘤鼠之间的生存时间。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GM-CSF在荷瘤小鼠体内表达检测

oHSV2给药后第2天检测到GM-CSF的表达，血清中的含量为（170±35.78）pg/mL。随着时间的延长，GMCS的表达逐渐升高，在第8天出现高峰，含量为（3150± 327.1）pg/mL。随后，GM-CSF表达量逐渐降低，在第20天，血清中的浓度为（266.67±53.17）pg/mL。PBS组在各个时点的血清中均未检测到GM-CSF（图1）。

2.2 oHSV2抑制肿瘤生长而不伴有明显毒副作用

在首次治疗后第28天，PBS组荷瘤小鼠平均体积为（2 197.67±121.97）mm3，oHSV2组平均肿瘤体积为（1 439.17±107.39）mm3，与对照组有显著性差异（P＜0.01）。5-FU组平均肿瘤体积为（1 309.53± 124.53）mm3，与对照组有显著性差异（P＜0.01），但两治疗组间肿瘤平均体积差异无统计学意义（P=0.08，图2A）。5-FU治疗后，小鼠体质量持续下降，在首次治疗后的第28天，荷瘤小鼠平均体质量为（16.61± 0.74）g，与PBS组有显著性差异（P＜0.01）。oHSV2组和PBS组荷瘤小鼠体质量均逐渐上升，在第28天体质量分别为（21.16±0.68）g、（22.07±0.54）g，两组间无统计学意义（P＞0.05，图2B）。在病毒瘤内注射治疗期间，小鼠未出现与治疗相关死亡，病毒注射部位及瘤周皮肤未发生坏死、溃疡。与阴性对照组相比（中位生存期为36 d），治疗组均显著延长小鼠中位生存期（图2C）。其中5-FU治疗组小鼠中位生存期为51 d（P＜0.01），溶瘤病毒治疗组小鼠中位生存期为50 d（P＜0.01）。但两治疗组间的小鼠中位生存期差异无统计学意义（P=0.55）。

2.3 oHSV2对荷瘤小鼠免疫影响

本研究通过流式细胞仪检测DC及T淋巴细胞比例变化。与PBS组相比，5-FU降低了TDLN内的DC比例（2.04%vs.3.73%，P＜0.05）。但oHSV2治疗组DC的平均比例则显著升高（6.49%vs.3.73%，P＜0.01）。同样，5-FU组小鼠瘤内CD4+T和CD8+T细胞比例相对于PBS组也明显降低（4.17%vs.8.57%，P＜0.05；2.98%vs.5.15%，P＜0.05）。而瘤体内T淋巴细胞比例在病毒组则显著提高（15%和8.19%，P＜0.01，图3）。

图1 血清中GM-CSF的含量变化Figure 1 GM-CSF serum concentrations over time following intratumoral injection of oHSV2 in tumor-bearing mice

图2 oHSV2有效抑制CT26移植瘤生长Figure 2 oHSV2 suppresses growth of CT26 colorectal tumors in mice

图3 oHSV2增强荷瘤小鼠抗肿瘤免疫Figure 3 oHSV2 increased antitumor immunity in vivo

3 讨论

目前，结直肠癌的治疗仍然是一个复杂而具有挑战性的临床问题。远处转移、化疗耐药、反复复发使得结直肠癌患者的预后较差。利用病毒治疗癌症是一种新颖的，具有发展前景的抗肿瘤方法。本实验首次研究Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒oHSV2治疗结直肠癌，选用传统结直肠癌化疗药物5-FU作为阳性对照组，更直接的观察病毒的抑瘤效果。

本研究结果显示，与PBS组相比，oHSV2组的小鼠肿瘤体积增长趋势明显下降，中位生存期明显延长，与5-FU药物的治疗效果相当。从临床角度看，oHSV2可能是结直肠癌理想的治疗方式，尤其对于低位直肠癌，复杂的盆腔结构以及肿瘤邻近肛门括约肌使得局部注射溶瘤病毒更加方便、有效［17］。在治疗过程中，病毒组小鼠体质量一直稳定增加，未发生与治疗相关的死亡，小鼠注射区域皮肤也未见溃疡、坏死。这表明oHSV2治疗较安全，毒副反应较少［18］。基础化疗药5-FU虽表现出积极的抗肿瘤效应，但由于化疗药物常伴有一定的毒副反应，其在杀伤肿瘤的同时，也引起小鼠体质量的下降。在临床上，患者接受化疗时出现体质量下降将影响预后［19］。

肿瘤的形成与发展有多种机制的参与，其中包括免疫抑制和免疫逃避［20］。肿瘤迅速发展的免疫抑制可导致临床治疗失败［21］。GM-CSF是具有多种免疫调节功能的细胞因子，能激活持久、特异的抗肿瘤免疫，其作用主要是刺激抗原递呈细胞和巨噬细胞的分化和活化。DC是最主要的抗原递呈细胞，在瘤体内，未成熟的DC捕获肿瘤抗原，加工处理后迁移到区域淋巴结分化为成熟的DC并通过MHCⅡ类分子将肿瘤抗原呈递给CD4+T，通过MHCⅠ类分子将肿瘤抗原呈递给肿瘤特异性CD8+T。研究表明单纯疱疹病毒载体搭载GM-CSF治疗小鼠结直肠癌模型比单独应用病毒载体疗效更显著［22-23］。在前期体外实验中，本研究发现oHSV2无论是高代次还是低代次均能高效表达GM-CSF，显示出良好的生物学稳定性［24］。感染病毒的荷瘤小鼠在第2天血清中检测到GM-CSF，并在第8天出现表达高峰，随后逐渐降低。而对照组血清中则一直未检测到。这表明oHSV2瘤内复制表达GM-CSF基因导致血液中GM-CSF增多。和其他溶瘤病毒一样，机体产生的抗病毒免疫会致使oHSV2被清除［25］，这也是血清GM-CSF浓度在完成注射后下降的主要原因。故溶瘤病毒不宜单独应用于治疗肿瘤，而是作为合理设计的联合治疗方案的一部分［26］。

免疫调节功能是通过GM-CSF调节CD11c阳性DC而展现的，而CD86阳性的DC才能成功激活和增殖T淋巴细胞［27］。TDLN单细胞悬液流式分析显示，与对照组相比，oHSV2组DC的比例显著提高。因此，瘤内注射oHSV2可导致局部GM-CSF积聚，吸引和促进DC的成熟。为了验证DC的功能，本研究检测了瘤体内的T淋巴细胞比例，结果显示oHSV2治疗后的小鼠瘤体内CD4+T与CD8+T比例显著升高。在肿瘤微环境中，CD4+T细胞能分泌多种细胞因子和表达表面分子发挥免疫调节作用。CD8+T在细胞免疫中至关重要，通过直接杀伤作用清除肿瘤细胞。研究结果同其他搭载GM-CSF的溶瘤病毒［28］。但在5-FU组，DC和T淋巴细胞均显著减少。一方面这可能因为化疗药物促进细胞凋亡，DC在这种非炎症环境下不能激活［29］。另一方面，和其他化疗药物一样，应用5-FU导致免疫抑制、淋巴细胞增殖受限［30］。因此，oHSV2通过调节GM-CSF的表达诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫是抑制肿瘤增殖的重要原因。

综上所述，oHSV2瘤内注射后有效抑制肿瘤细胞生长增殖而不伴有明显毒副反应。病毒体内复制表达具有生物活性的GM-CSF可诱导产生特异性的抗肿瘤免疫。因此，oHSV2可以通过直接溶瘤效应［15］和促进免疫系统杀伤癌细胞的双重机制来治疗肿瘤。这将为oHSV2联合其他肿瘤治疗方案在结直肠癌治疗中的应用提供新的思路和方向，并为进一步阐明oHSV2对结直肠癌的疗效奠定实验基础。

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（2016-09-19收稿）

（2017-02-03修回）

（编辑：武斌校对：孙喜佳）

Preclinical evaluation of recombinant herpes simplex virus oHSV2 in colorectal cancer

Lei YIN1,2,3,Yanlai SUN2,Chunhong ZHAO3,Zengjun LI2,Yanan ZHEN3,Ruixue XIAO3,Zhongfa XU3
Correspondence to:Zhongfa XU;E-mail:xzf2216@126.com

1School of Medicine and Life Sciences,University of Ji'nan-Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250022,China;2Fourth Surgical Department,Shandong Tumor Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250117,China;3Second Surgical Department,Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250031,China

This study was supported by the Science and Technology Development Projects of Shandong Province(No.2013GSF11834),Youth Program of Shandong Academy of the Medical Sciences Technology Plan(Nos.2014-56 and 2014-61),Projects of Medical Science and Technology Development in Shandong Province(Nos.2015WS0149 and 2015WS0197),and the Natural Science Foundation of Shandong Province(No.ZR2013HL040)

Objective:To investigate therapeutic efficacy and mechanisms of action of oncolytic agent derived from herpes simplex virus type 2(oHSV2)in a xenograft mouse model bearing CT26 colorectal cancer.Methods:BALB/c mice were subcutaneously inoculated with CT26 cells to establish a xenograft mouse model of colorectal cancer.1)After intratumoral administration of oHSV2,enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)expression levels in the blood. 2)Model mice were divided into three groups:PBS group(negative control),oHSV2 group,and 5-fluorouracil(5-FU)group(positive control). After drug administration,drug effectiveness was evaluated on the basis of weight,tumor volume,general state,and survival time.3)Cells from the draining lymph nodes(TDLN)and tumor were surgically removed and used to quantify mature dendritic cells(DCs)and T lymphocytes by flowcytometry.Result:1)In the CT26 xenograft model,level of GM-CSF continuously elevated.At day 8,peak value was attained in the blood at concentration of 3150±327.1 pg/mL.Then,GM-CSF expression gradually reduced as time progressed.2)In in vivo study, both oHSV2 and 5-FU exerted antitumor effects relative to PBS group(50 days vs.36 days,P＜0.01;51 days vs.36 days,P＜0.01),and oHSV2 proved to be less toxic and safer.At day 28,the 5-FU group presented highly significant difference in mouse body weight compared with that of PBS group(16.61 g vs.22.07 g,P＜0.01).However,oHSV2 group did not show statistically significant change(all P＞0.05).Skin of virus injection region did not present necrosis and ulceration.3)In the TDLN,the frequency of DC was increased when treated with oHSV2 compared with the control group(6.49%vs.3.73%,P＜0.01).Similarly,the percentage of CD4+and CD8+T-cells from the oHSV2-treated groupwas signifcantly higher than mock-treated tumors(15%vs.8.57%,P＜0.01;8.19%vs.5.15%,P＜0.01).However,number of cells in the 5-FU group were significantly reduced with respect to that of the negative group(all P＜0.01).Conclusion:oHSV2 exerted potent antitumor effects in a murine colorectal cancer model.Compared with 5-FU,oHSV2 treatment caused fewer side effects.Such antitumor effect may be induced by stimulation of immune activity by GM-CSF production.

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