LASS2-3'-非翻译区rs8444单核苷酸多态性与膀胱癌易感性的相关性研究*

2017-03-03陈玉锦王海峰颜汝平柯昌兴丁明霞栾婷邹仁超王剑松

中国肿瘤临床 2017年3期

陈玉锦王海峰颜汝平柯昌兴丁明霞栾婷邹仁超王剑松

·临床研究与应用·

陈玉锦①②王海峰①颜汝平①柯昌兴①丁明霞①栾婷①邹仁超①王剑松①

目的：探讨人源性长寿保障基因2（Homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2）-3'-非翻译区（UTR）单核苷酸多态性与中国云南地区膀胱癌人群之间的相关性。方法：选择2011年1月至2015年1月在昆明医科大学第二附属医院就诊且经病理学确诊的105例膀胱癌作为膀胱癌组、100例非膀胱癌作为对照组进行病例对照研究，对两组患者的膀胱组织进行基因扩增和测序，分析研究LASS2-3'-非翻译区单核苷酸多态性与膀胱癌之间的相关性。结果：在LASS2-3'-非翻译区仅发现1个单核苷酸多态性位点rs8444，经χ2检验和Logistic回归分析显示，膀胱癌组和对照组rs8444T/C等位基因频率及基因型分布差异具有统计学意义（χ2=10.267，P=0.006；χ2=10.634，P=0.001）。与携带T等位基因或TT基因型相比，携带C等位基因或CC基因型的个体发生膀胱癌的风险显著降低（OR=0.489，95%CI为0.309～0.772，P=0.002；OR=0.258，95%CI为0.081～0.827，P=0.023），但与膀胱癌的TNM分期、病理分级和有否转移无明显相关性（P＞0.05）。结论：LASS2-3'-非翻译区rs8444C等位基因和CC基因型可降低膀胱癌的发病风险，但与膀胱癌的TNM分期、病理分级和转移情况无关。

LASS2 膀胱癌多态性单核苷酸

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，在全球男性恶性肿瘤中位居第6位，每年全球有近429 800例新发病例和165 100例死亡病例，不同地区膀胱癌的发病率可相差10倍［1］。根据中国癌症登记中心数据，2011年中国膀胱癌发病率为7.68/105、死亡率为1.99/105，膀胱癌发病率与死亡率均居泌尿系统肿瘤前列［2-3］。人源性长寿保障基因2（Homo sapi⁃ens longevity assurance homologue 2，LASS2）位于染色体1q11，含有保守的TLC域和特定的HOX域，在促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭及转移中发挥着重要作用［4］。此前的研究结果［5］已证实，LASS2可明显抑制膀胱癌细胞增殖，其表达水平与膀胱癌细胞株侵袭能力呈负相关，在膀胱癌的发生发展中扮演着抑癌基因的作用。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是最常见的基因遗传变异，通过改变基因结构或表达量影响基因对机体的调控作用。目前有关LASS2基因多态性的研究较少［6］，尤其LASS2单核苷酸多态性与膀胱癌相关性的研究国内外鲜有报道。因此，本研究对膀胱癌患者的LASS2-3'-非翻译区（LASS2-3'-UTR）进行测序分析，探讨SNPs与膀胱癌之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

选择2011年1月至2015年1月105例昆明医科大学第二附属医院就诊且确诊为膀胱癌的患者，其中汉族90例、回族4例、白族3例、彝族3例、哈尼族2例、壮族1例、傣族1例、傈僳族1例。选取100例同期就诊、经膀胱镜检查后病理确诊的非膀胱癌患者作为对照组，包括73例慢性膀胱炎、15例膀胱息肉、7例膀胱憩室、2例乳头状膀胱炎、2例膀胱结核和1例膀胱平滑肌瘤，排除其他恶性肿瘤史、有明确膀胱癌家族史、以及前列腺特异抗原（PSA）＞4 ng/mL的前列腺增生的患者，其中汉族87例、回族6例、彝族3例、纳西族1例、白族1例、哈尼族1例、苗族1例。所有膀胱癌患者均首次诊断为原发性膀胱移行细胞癌，并根据2009年国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准（第7版）确定肿瘤的TNM分期，诊疗之前未经过其他治疗。膀胱癌组和对照组所选对象均为长期居住于云南地区人群。所有的组织样本一经采集立刻置于液氮中，随后保存于-80℃超低温冰箱。所有试剂均购自北京天根生化科技有限公司。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签属知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取按照血液/组织/细胞基因组提取试剂盒中的操作说明对收集的临床组织样本进行全基因组DNA提取，将DNA浓度稀释至20 ng/mL，-20℃保存。

1.2.2 聚合酶链式反应（PCR）应用Gene Bank检索LASS2-3'-UTR序列，采用Primer Premer 5.0和Blast软件设计并检测LASS2-3'-UTR引物后，利用PCR混合液对总DNA进行扩增。LASS2上游引物为5'-CCAAAGCTGGACCAAGGCTA-3'；下游引物为5'-GCAAGGAAGGCATAAGAAAGACT-3'。PCR反应体系为25 uL，包括20 ng基因组DNA、1×PCR缓冲液及400 nM上下游引物。反应条件为95℃预变性0.5 min，95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

1.2.3 DNA测序 PCR扩增后的产物经过1.5%凝胶电泳检测后，进行测序。

1.3 统计学处理

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料使用均数±标准差（±s）表示，采用t检验分析；计数资料采用χ2检验分析，检测纳入样本的人群是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。SNPs和膀胱癌风险之间的关系采用非条件Logistic回归分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征

膀胱癌组共纳入了105例患者，平均年龄为（60.95±9.62）岁，汉族90例，男性82例；对照组共纳入了100例患者，平均年龄为（62.45±11.18）岁，汉族87例，男性74例。两组资料均以汉族为主，年龄、民族、性别差异无统计学意义（均P＞0.05），匹配性良好。

2.2 LASS2-3'-UTR基因序列分析

本研究对膀胱癌组与对照组患者的膀胱组织样本进行PCR扩增和LASS2-3'-UTR序列测定和分析，并与Gene Bank检索的LASS2-3'-UTR序列进行比对，结果显示仅在基因片段的120～140 bp位置发现rs8444T/C这一SNPs位点，而片段中其他则为碱基保守序列（图1）。

2.3 Hardy-Weinberg平衡法则的吻合度检验

膀胱癌组与对照组多态性位点的基因型观察值与期望值检测均符合Hardy-Weinberg平衡定律，吻合良好（P＞0.05），表明本研究对象来自大的群体，具有较好的代表性（表1）。

2.4 LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因频率和基因型与膀胱癌发生风险的关系

膀胱癌组和对照组LASS2-3'-UTR的rs8444位点T/C等位基因频率及基因型分布差异具有统计学意义，膀胱癌组中携带C等位基因或CC基因型的比例均显著低于对照组（均P＜0.01）。经年龄、性别校正后，Logistic回归分析结果显示，与携带T等位基因或TT基因型相比，携带C等位基因或CC基因型者膀胱癌发生风险显著降低；携带TC基因型者较携带TT基因型者膀胱癌发生风险降低，但差异无统计学意义（表2）。

图1 LASS2-3'-UTR测序结果Figure 1 Sequencing result for the SNP in LASS2-3'-UTR

表1 LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C基因型分布和等位基因频率分布Table 1 T/C allele frequencies and genotype distributions of rs8444 in LASS2-3'-UTR

表2 LASS2-3'-UTR的rs8444多态性与膀胱癌的相关性Table 2 Relationship between rs8444 polymorphisms in LASS2-3'-UTR and bladder cancer risk

2.5 LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因频率和基因型与膀胱癌临床病理参数之间的关系

在纳入的105例膀胱癌患者中，经年龄、性别校正后，Logistic回归分析结果显示，LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因频率和基因型分布与膀胱癌临床分期、病理分级以及膀胱癌转移与否均无明显相关性（均P＞0.05，表3）。

表3 LASS2-3'-UTR的rs8444多态性与膀胱癌临床病理参数的相关性Table 3 Relationship between rs8444 polymorphisms in LASS2-3'-UTR and clinicopathological characteristics of bladder cancer

表3 LASS2-3'-UTR的rs8444多态性与膀胱癌临床病理参数的相关性（续表3）Table 3 Relationship between rs8444 polymorphisms in LASS2-3'-UTR and clinicopathological characteristics of bladder cancer

3 讨论

膀胱癌的发生发展是一个有多因素参与、多步骤的复杂过程，与遗传、环境等因素密切相关，其分子机制目前尚不完全清楚。截至目前，已确认多个与膀胱癌易感性相关的SNPs，如染色体3q28区域rs710521位点［7］以及前列腺干细胞抗原基因（prostate stem cell antigen，PSCA）的rs2294008和rs2978974位点［8］。此外，与膀胱癌易感性相关的SNPs也存在着种族和地域差异，如TP53基因密码子72（TP53 Arg72Pro）多态性增加了南亚克什米尔人群的膀胱癌易感性［9］，但与北欧人群膀胱癌的发病风险无关［10］。

LASS2基因是一个新发现的肿瘤抑制基因，与膀胱癌［5］、前列腺癌［11］、乳腺癌［12］等多种肿瘤的发生发展密切相关。目前针对LASS2基因多态性的研究较少，除Amos等［6］研究发现LASS2基因1q21.3上的SNPs位点rs7412746是皮肤黑色素瘤的易感基因外，国内外鲜见LASS2基因多态性与肿瘤相关性研究的报道。本研究通过对膀胱癌组与对照组患者的膀胱组织样本进行LASS2-3'-UTR测序，并与Gene Bank检索的LASS2-3'-UTR序列进行比对后仅发现rs8444 T/C这一SNPs位点。进一步分析发现，膀胱癌组和对照组LASS2-3'-UTR的rs8444位点T/C等位基因频率及基因型分布差异具有统计学意义，膀胱癌组中携带C等位基因或CC基因型的比例均显著低于对照组（59.52%vs.74.50%，χ2=10.634，P=0.001；35.24%vs.55%，χ2=10.267，P=0.006）；与携带T等位基因或TT基因型相比，携带C等位基因或CC基因型的个体可分别降低0.489倍或0.258倍的膀胱癌发病风险（OR=0.489，95%CI为0.309～0.772，P=0.002；OR= 0.258，95%CI为0.081～0.827，P=0.023）。此外，本研究对LASS2-3'-UTR的rs8444位点T/C等位基因频率及基因型与膀胱癌临床病理参数的相关性也进行了分析，结果发现LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因频率和基因型分布在不同的临床分期、病理分级和有否转移的膀胱癌患者间无显著性差异（均P＞0.05）。以上结果初步提示LASS2-3'-UTR的rs8444位点C等位基因和CC基因型可降低膀胱癌的发病风险，但与膀胱癌临床分期、病理分级和有否转移等无明显相关性。

众所周知，基因通过3'-非翻译区与其上游的miRNA靶向结合，基因mRNA降解或翻译抑制依赖于其上游miRNA表达量，以及基因mRNA转录本和miRNA之间的互补程度［13］。即使靶基因3'-非翻译区只发生了单个核苷酸的改变，都有可能破坏原有的或产生新的miRNA靶基因结合位点，影响肿瘤相关基因的表达［14］，进而影响肿瘤的发生发展［15］。因此本研究推测，LASS2-3'-UTR的rs8444位点C等位基因和CC基因型通过改变上游miRNA与LASS2基因的结合能力甚至是结合位点，增加LASS2转录后水平的活性，使LASS2基因表达增加，从而降低膀胱癌发生的风险；LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C多态性与膀胱癌进展无明显相关性，可能是由于膀胱癌发生发展的机制复杂多变，单一基因多态性并不能完全解释肿瘤的进展。此外本项研究尚有一定局限性：1）本研究是以医院为基础的病例对照研究，固有的选择偏差不能完全排除；2）本研究非大样本数据研究，样本量的适中削弱了分层分析的统计学强度；3）云南虽然是个多民族地区，但本组资料仍以汉族为主，其他少数民族病例数过少，限制了对民族因素的进一步分析。

综上所述，LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C多态性与膀胱癌易感性密切相关，但与肿瘤进展无关；C等位基因和CC基因型可降低膀胱癌的发病风险，可能是膀胱癌的一个新的保护因素。下一步将对LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C多态性影响膀胱癌易感性的可能机制进行深入研究，并进一步扩大样本量，探讨与少数民族交互的关系。

[1]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J]. CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):E359-386.

[3]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015 [J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[4]Xu XY,Pei F,You JF.TMSG-1 and its roles in tumor biology[J].Chin J Cancer,2010,29(7):697-702.

[5]Zhao Q,Wang H,Yang M,et al.Expression of a tumor-associated gene,LASS2,in the human bladder carcinoma cell lines BIU-87, T24,EJ and EJ-M3[J].Exp Ther Med,2013,5(3):942-946.

[6]Amos CI,Wang LE,Lee JE,et al.Genome-wide association study identifies novel loci predisposing to cutaneous melanoma[J].Hum Mol Genet,2011,20(24):5012-5023.

[7]Stern MC,Van Den Berg D,Yuan JM,et al.Sequence variant on 3q28 and urinary bladder cancer risk:findings from the Los Angeles-Shanghai bladder case-control study[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2009,18(11):3057-3061.

[8]Fu YP,Kohaar I,Rothman N,et al.Common genetic variants in the PSCA gene influence gene expression and bladder cancer risk[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(13):4974-4979.

[9]Pandith AA,Shah ZA,Khan NP,et al.Role of TP53 Arg72Pro polymorphism in urinary bladder cancer predisposition and predictive impact of proline related genotype in advanced tumors in an ethnic Kashmiri population[J].Cancer Genet Cytogenet,2010,203(2): 263-268.

[10]Pineda S,Milne RL,Calle ML,et al.Genetic variation in the TP53 pathway and bladder cancer risk.a comprehensive analysis[J]. PLoS One,2014,9(5):e89952.

[11]Yu W,Wang L,Wang Y,et al.A novel tumor metastasis suppressor gene LASS2/TMSG1 interacts with vacuolar ATPase through its homeodomain[J].J Cell Biochem,2013,114(3):570-583.

[12]Fan S,Niu Y,Tan N,et al.LASS2 enhances chemosensitivity of breast cancer by counteracting acidic tumor microenvironment through inhibiting activity of V-ATPase proton pump[J].Oncogene, 2013,32(13):1682-1690.

[13]Ambros V.The functions of animal microRNAs[J].Nature,2004,431 (7006):350-355.

[14]Preskill C,Weidhaas JB.SNPs in microRNA binding sites as prognostic and predictive cancer biomarkers[J].Crit Rev Oncog,2013,18 (4):327-340.

[15]Shaw G.Polymorphism and single nucleotide polymorphisms(SNPs) [J].BJU Int,2013,112(5):664-665.

（2016-10-27收稿）

（2017-01-16修回）

Analysis of the correlation between rs8444 polymorphisms located within LASS2-3′-UTR and susceptibility of bladder cancer

Yujin CHEN1,2,Haifeng WANG1,Ruping YAN1,Changxing KE1,Mingxia DING1,Ting LUAN1,Renchao ZOU1,Jiansong WANG1
Correspondence to:Jiansong WANG;E-mail:jiansongwang@126.com

1Department of Urology,The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Yunnan Institute of Urology,Kunming 650101, China;2Department of Nephrology,New District Hospital of People's Hospital of Chuxiong Yi Autonomous Prefecture,Chuxiong 675000,China

This work was supported by the Project of Yunnan Provincial Science and Technology(No.2015FB196)and the Yunnan Provincial Department of Education Fund(No.2014Z072)

Objective:To explore the correlation between single nucleotide polymorphisms(SNPs)in Homo sapiens longevity assurance homologue 2(LASS2)gene 3′‐untranslated regions(UTR)and susceptibility of bladder cancer among residents of Yunnan,China.Methods:A total of 105 bladder cancer patients(bladder cancer group)and 100 nonbladder cancer patients(control group)were selected.PCR method and sequence for LASS2-3′‐UTR were performed to identify the SNPs correlated with bladder cancer.The relationships between the LASS2-3′‐UTR polymorphisms and bladder cancer risk were analyzed.Results:An SNP(rs8444)was identified in LASS2-3′‐UTR,and the T/C allele frequencies and genotype distributions of rs8444 largely differed between the bladder cancer and control groups(χ2=10.267,P=0.006;χ2=10.634,P=0.001).Individuals that carry the rs8444 C allele or CC genotype had a remarkably lower risk of bladder cancer compared with those that carry the T allele or TT genotype(OR=0.489,95%CI:0.309-0.772,P=0.002;OR= 0.258,95%CI:0.081-0.827,P=0.023).No significant correlations were observed between the T/C allele frequencies and genotype distributions of rs8444 and TNM stage,as well as histological grade and distant metastasis in bladder cancer(P＞0.05).Conclusion:The rs8444 C allele or CC genotype located within LASS2-3′‐UTR can lower the susceptibility of bladder cancer among the residents of Yunnan,China.However,it is not associated with the TNM stage,histological grade,and distant metastasis.

Homo sapiens longevity assurance homologue 2,bladder cancer,polymorphism,single nucleotide