程序化细胞死亡因子5对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和自噬的影响及机制

任安立， 李靖凯， 周冬冬

(焦作市人民医院胸外科， 河南 焦作 454002)

程序化细胞死亡因子5对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和自噬的影响及机制

任安立△， 李靖凯， 周冬冬

(焦作市人民医院胸外科， 河南 焦作 454002)

目的： 探讨程序化细胞死亡因子5(PDCD5)对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞凋亡和自噬的影响及其作用机制。方法：以H9c2心肌细胞系为研究对象，建立H/R损伤模型，采用RNA干扰方法抑制PDCD5的表达，MTT法检测心肌细胞的存活率，TUNEL显色法检测细胞凋亡率，RT-qPCR和Western blot法分别检测mRNA和蛋白的表达水平。结果：H/R损伤的H9c2心肌细胞中，PDCD5表达水平升高，同时细胞的存活率降低，细胞凋亡率和自噬水平增加。而PDCD5沉默能够增加细胞存活率，同时减少细胞凋亡率，促进Bax表达，且抑制抑Bcl-2、LC3-II/LC3-I及自噬相关蛋白beclin-1的表达。此外，沉默PDCD5可通过降低p-P65的蛋白水平抑制NF-κB通路。结论：沉默PDCD5通过阻断NF-κB信号通路而抑制H/R损伤诱导的心肌细胞凋亡和自噬，从而保护心肌细胞。

心肌细胞； 缺氧/复氧损伤； 程序化细胞死亡因子5； 细胞凋亡； 自噬

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是缺血性心脏病临床治疗中最常见的一种病理损害，可加重心肌结构破坏和心功能障碍，是影响缺血性心脏病临床治疗及预后的重要因素[1]。细胞的凋亡和自噬存在于心肌I/R过程中，在缺血初期主要起保护作用，再灌注期则加重细胞损伤，导致细胞死亡[2]。细胞凋亡和自噬被认为与心肌I/R损伤密切相关[3-4]。

程序化细胞死亡因子5(programmed cell death 5，PDCD5)是来自于TF21细胞克隆的基因，能够促进不同凋亡诱导因素触发的细胞凋亡。研究发现，PDCD5与心血管系统多种疾病相关，在心肌梗死[5]、心肌细胞氧化应激[6]及大鼠心肌I/R[7]等病理生理过程中表达明显上调。有研究报道PDCD5通过抑制心肌重塑而改善心脏功能[8]。然而PDCD5在心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤诱导的凋亡和自噬中的作用及机制目前尚未见报道。本实验建立体外心肌细胞H/R模拟在体心肌细胞I/R，观察PDCD5对H/R诱导的心肌细胞自噬和凋亡的影响及其可能机制，为后期研究心脏缺血、缺氧状态下心肌细胞凋亡和自噬的相互关系奠定基础。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠H9c2心肌细胞系(北京协和细胞库)；PDCD5小干扰RNA系列(si-PDCD5)和阴性对照(negative control,NC)小干扰RNA系列(si-NC)和PCR引物由上海生物工程有限公司合成；DMEM培养基和胎牛血清(HyClone)； LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen)；TRIzol试剂盒、RT-PCR试剂盒和SYBR Green Premix Ex TaqTM(TaKaRa)；RIPA裂解液、BCA蛋白质定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；PVDF膜(Millipore)；增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒(Santa Cruz)；MTT和DMSO(Sigma)；TUNEL检测试剂盒(Promega)。

2 方法

2.1 细胞培养 H9c2细胞置于10% 胎牛血清的DMEM培养基(37 ℃ 、5%CO2)中培养。细胞每2～3 d换液1次。当细胞汇合至约90%时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，采用第3～4代细胞进行实验。

2.2 H/R模型建立及实验分组 用5% CO2和95% N2混合气饱和1 h的模拟缺氧液(无糖无血清的DMEM培养基)置换H9c2心肌细胞正常培养基，在含5% CO2和95% N2的37 ℃密闭培养箱中缺氧培养4 h，再将5% CO2和95%空气饱和的模拟复氧液(含10% FBS的DMEM培养基)置换缺氧液，置于正常条件下培养4 h即复氧。将H9c2心肌细胞随机分为正常对照(control)组(细胞正常培养，不做任何处理)、H/R组(细胞缺氧4 h复氧4 h处理)、H/R+ si-NC组(细胞转染阴性对照siRNA后经H/R处理)和H/R+si-PDCD5组(细胞转染PDCD5 siRNA后经H/R处理)。

2.3 siRNA转染 H9c2细胞接种于6孔板中，待细胞生长达60%～70%汇合时，采用LipofectamineTM2000根据操作步骤将si-PDCD5和si-NC转染至H9c2细胞，6 h后换成正常培养基培养。48 h后收集细胞，通过Western blot实验检测PDCD5蛋白水平来验证干扰细胞株的构建是否成功。

2.4 RT-qPCR实验 采用TRIzol提取细胞总RNA，酶标仪检测RNA的浓度。用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，应用ABI 7500型定量PCR仪，通过SYBR Green试剂检测目的基因的表达水平。PDCD5的上游引物序列为5’-GGAAGCAG-AAATGAGAACAG-3’，下游引物为5’-TTAGTAATCA-TCATCTTCATC-3’；GAPDH的上游引物为5’-CCACAGTCCATGCCATCACT-3’，下游引物为5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。反应参数为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s、62.2 ℃ 45 s、72 ℃ 2 min，40个循环；72 ℃ 8 min。每组设置3个复孔，以GAPDH作为内参照，目的基因的相对表达水平根据2-ΔΔCt法计算。

2.5 Western blot实验检测蛋白水平 收集各组细胞，RIPA裂解液裂解细胞，离心提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。10% SDS-PAGE分离蛋白。将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉缓冲液封闭液室温封闭2 h，漂洗后分别加入对应Ⅰ抗(PDCD5、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bax、Bcl-2、beclin-1、p-P65、P65和GAPDH抗体)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5 min、3次， Ⅱ抗室温孵育1 h，TBST洗膜，使用ECL显色试剂显影、扫描，采用软件Quantity One V4.62分析。

2.6 MTT法检测细胞存活率 取对数生长期细胞接种于96孔板中，接种密度为1×108/L，每组设5个复孔。处理结束后向每孔分别加入20 μL的MTT溶液，于CO2培养箱中继续孵育4 h。弃上清，每孔加入150 μL的DMSO震荡培养10 min，待蓝色结晶体充分溶解，用酶标仪测定490 nm波长处吸光度值。

2.7 脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)法检测心肌细胞凋亡 各组心肌细胞于4%甲醛固定，采用TUNEL凋亡试剂盒检测凋亡心肌细胞，阴性对照不加TDT酶，以核阳性(细胞核呈黄褐色)为判定标准。显微镜下观察，各组随机选取10个高倍视野计数，分别统计每个视野细胞核总数及凋亡阳性细胞核数，最后计算心肌细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)：AI(%)=凋亡阳性细胞核数/总细胞核数×100%。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0 统计软件对数据进行统计学分析，应用Graph Pad Prism 5 软件作图。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 H/R对H9c2细胞中PDCD5表达水平的影响

RT-qPCR和Western blot检测结果显示H9c2细胞经H/R处理后，PDCD5的mRNA和蛋白水平均明显增加(P<0.05)。由此表明PDCD5在H/R损伤的H9c2细胞中高表达，此结果与前期研究结果一致[7]。为研究PDCD5在心肌细胞H/R损伤中的作用，采用RNA干扰的方法沉默PDCD5基因，结果发现转染si-PDCD5后，PDCD5蛋白表达的水平显著下降(P<0.05)，提示si-PDCD5能够有效沉默H9c2细胞PDCD5基因，见图1。

Figure 1.The expression of PDCD5 in H/R-induced H9c2 cells. The mRNA (A) and protein (B) expression of PDCD5 was detected by RT-qPCR and Western blot, respectively. The transfection efficiency of si-PDCD5 (C) was determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R+si-NC.

图1 H/R对H9c2细胞中PDCD5表达水平的影响

2 PDCD5对H/R诱导的心肌细胞存活率的影响

采用MTT法检测心肌细胞存活率，结果如图2所示。H/R损伤后细胞存活率明显降低(P<0.05)，沉默PDCD5可显著提高细胞的存活率(P<0.05)，提示敲减PDCD5可以减轻H/R诱导的H9c2细胞损伤。

3 PDCD5对H/R诱导的心肌细胞凋亡的作用

进一步采用TUNEL检测心肌细胞凋亡率，结果显示，H/R组相比对照组凋亡率明显升高(P<0.05)，而PDCD5下调能够降低H/R诱导的心肌细胞凋亡率(P<0.05)。采用Western blot实验检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平显示，H/R损伤的心肌细胞中，促凋亡蛋白Bax的表达明显上升，抑凋亡蛋白Bcl-2明显下调。沉默PDCD5可显著抑制Bax的表达，同时促进Bcl-2表达。综合以上结果说明敲减PDCD5抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡，见图3。

Figure 2.Silence ofPDCD5 suppressed H/R-induced cell viability in the H9c2 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R+si-NC.

图2 沉默PDCD5的可抑制H/R诱导的心肌细胞损伤

Figure 3.Knockdown ofPDCD5 inhibited H/R-induced cell apoptosis in the H9c2 cells. A: the TUNEL assay was used to determine the apoptosis of H9c2 cells; B: the protein expression of Bax and Bcl-2 was detected by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R+si-NC.

图3 沉默PDCD5可抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡

4 PDCD5对H/R诱导心肌细胞自噬的作用

通过Western blot实验检测细胞中LC3-II和LC3-I的表达比例及自噬相关蛋白beclin-1表达水平判断心肌细胞的自噬情况，结果如图4所示。H/R诱导的心肌细胞中LC3-II/LC3-I及beclin-1蛋白水平显著升高，而沉默PDCD5可明显降低LC3-II/LC3-I比值并下调beclin-1的表达，由此表明敲减PDCD5能够抑制H/R诱导的心肌细胞的自噬水平。

Figure 4.Knockdown ofPDCD5 decreased H/R-induced cell autophagy in the H9c2 cells. The protein expression of LC3-II/LC3-I and beclin-1 was determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R+si-NC.

图4 沉默PDCD5可抑制H/R诱导的心肌细胞自噬

5 PDCD5对H/R诱导心肌细胞中NF-κB通路的影响

Western blot结果显示H/R损伤的细胞中p-P65的蛋白水平上调，而沉默PDCD5则明显抑制p-P65的蛋白水平。以上结果表明沉默PDCD5可抑制NF-κB通路，见图5。

Figure 5.Knockdown ofPDCD5 prevented the activity of NF-κB signaling in the H9c2 cells under H/R injury. The protein level of p-P65 and P65 was determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R+si-NC.

图5 沉默PDCD5可抑制H/R诱导的心肌细胞中的NF-κB通路

讨 论

I/R诱导的心肌损伤是一种复杂的多因素病理生理过程，往往伴随着心肌细胞的坏死、凋亡以及自噬。心肌细胞H/R可在一定程度上模拟心肌I/R损伤，研究证实H/R可诱导心肌细胞凋亡和自噬。

心肌细胞凋亡增加和生存率降低是I/R诱导的心肌损伤、梗死后病理性心肌重塑、心力衰竭等疾病发生的重要机制。本实验的结果表明H/R抑制心肌细胞的生存率，诱导细胞凋亡；PDCD5沉默使得细胞生存率升高，降低细胞凋亡率。I/R心肌细胞凋亡的发生是在多种凋亡相关基因的调控下进行的，目前bcl-2和bax被认为是最重要的细胞凋亡相关基因[9]。已有研究表明Bcl-2蛋白通过抑制caspase-3的活性从而抑制细胞凋亡。而Bax蛋白虽为Bcl-2家族蛋白成员，其功能却与Bcl-2蛋白相反，具有促凋亡作用[10]。进一步检测PDCD5对凋亡相关蛋白表达的影响，结果显示H/R损伤的心肌细胞中Bax表达上调，Bcl-2表达下调。抑制PDCD5表达能够降低H/R诱导的Bax的表达，同时升高Bcl-2表达水平。上述结果表明H/R可诱导心肌细胞凋亡，沉默PDCD5的表达能够抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡。

随着研究的深入，研究人员逐渐发现H/R不仅能够引起心肌细胞的坏死和凋亡，还可引发心肌细胞自噬。自噬相关蛋白beclin-1是细胞自噬发生所必须的蛋白。诸多研究表明，I/R过程中心肌自噬表达增强，并和凋亡之间存在紧密联系，如Bcl-2表达下调不仅可以诱发凋亡，而且可通过激活beclin-1来激活自噬[11]。有研究表明心肌细胞I/R损伤后能够产生大量的活性氧，从而诱导beclin-1大量表达，进而增加细胞的自噬水平[12]。因而通过抑制beclin-1的表达能够抑制细胞的自噬作用。本研究发现，H/R损伤可诱使心肌细胞beclin-1上调，证实H/R可诱发细胞自噬，而沉默PDCD5的表达能够抑制beclin-1表达。综合以上结果表明沉默PDCD5的表达能够抑制H/R诱导的心肌细胞的自噬。

NF-κB信号通路不仅能够调节细胞死亡的2个经典途径即坏死和凋亡，还与自噬途径密切相关，同时还可调节与凋亡相关的蛋白Bcl-2和Bax的表达[13]。NF-κB通路激活能够导致I/R所诱导的心肌炎证反应、凋亡、坏死及心功能下降[14]。NF-κB通路在自噬和凋亡途径中具有重要作用[15]。有研究报道NF-κB参与I/R诱导的自噬体的形成，抑制NF-κB的活性对于I/R诱导的自噬过表达及损伤的心肌细胞具有保护作用[13]。本研究结果显示H/R可激活NF-κB信号通路，而沉默PDCD5能够阻断NF-κB通路，进而通过调节凋亡相关基因bcl-2和bax及自噬相关基因LC3-II/LC3-I和beclin-1的表达水平，从而参与H/R诱导的心肌细胞凋亡及自噬过程。

综上所述，沉默PDCD5可通过阻断NF-κB通路抑制H/R诱导的心肌细胞的凋亡和自噬，从而发挥心肌保护作用，这可能为预防和治疗心肌缺血再灌注损伤提供新策略。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Effects of PDCD5 on hypoxia/reoxygenation-induced autophagy and apoptosis of cardiomyocytes

REN An-li, LI Jing-kai, ZHOU Dong-dong

(DepartmentofThoracicSurgery,ThePeople’sHospitalofJiaozuoCity,Jiaozuo454002,China.E-mail:anliren66@163.com)

AIM: To investigate the influence of programmed cell death 5 (PDCD5) on apoptosis and autophagy in the cardiomyocytes exposed to hypoxia/reoxygenation (H/R) and its potential mechanism. METHODS: H9c2 cells were exposed to H/R. PDCD5 was downregulated by RNA interference. The cell viability was measured by MTT assay. TUNEL assay was used to detect cell apoptosis. The mRNA and protein levels were determined by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: The expression of PDCD5 was upregulated in the cardiomyocytes after H/R injury. Furthermore, H/R injury obviously reduced the cell viability and enhanced the apoptosis and autophagy of the cardiomyocytes. However, knockdown ofPDCD5 increased the cell viability, and attenuated H/R-induced apoptosis, accompany with reduction of Bax and augment of Bcl-2 expression. Additionally, silencingPDCD5 markedly inhibited H/R-induced autophagy by regulating the expression of LC3-II/LC3-I and beclin-1. Moreover, downregulation ofPDCD5 suppressed NF-κB signaling by redu-cing the protein level of p-P65. CONCLUSION: SilencingPDCD5 suppresses H/R-induced H9c2 cells apoptosis and autophagy by blocking NF-κB signaling pathway. The result indicates a new strategy for the prevention and treatment of myocardial I/R injury.

Cardiomyocytes; Hypoxia/reoxygenation; Programmed cell death 5; Apoptosis; Autophagy

1000- 4718(2017)02- 0251- 06

2016- 09- 19

2016- 10- 21

R363； R542.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.010

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 0391-2105211； E-mail： anliren66@163.com