珍珠层生物性能及成骨诱导能力研究进展

郑斌，徐普

(中南大学湘雅医学院附属海口医院·海南省口腔医学中心口腔种植科，海南海口570208)

珍珠层生物性能及成骨诱导能力研究进展

郑斌，徐普

(中南大学湘雅医学院附属海口医院·海南省口腔医学中心口腔种植科，海南海口570208)

珍珠层作为骨修复材料，具有诱导成骨作用、合适的降解性能以及良好的力学性能。文章综述了珍珠层的结构及成分、细胞相容性和生物降解性及对前成骨细胞和骨髓间充质干细胞的成骨诱导作用，同时展望了其作为骨缺损修复材料的应用前景。

珍珠层；前成骨细胞；间充质干细；成骨诱导

牙周病、外伤、肿瘤和炎症均可导致骨缺损，难以恢复的骨缺损困扰着成千上万人，并且严重影响他们的生活质量。有些情况下，骨结构改变能影响人机体平衡。因此，适用于人体生物材料的研发显得尤为重要，促进骨移植材料研发水平不断提高。目前，来源于人的异体骨和动物的异种骨因不受供应限制而被广泛使用，但存在着介导免疫反应的危险[1]。人工骨替代异体骨或异种骨避免了不良反应出现，具有良好的应用前景。Lopez等[2]于1992年发现贝壳珍珠层具有良好的生物相容性和成骨诱导性，促进了人工骨修复材料应用研发进展。相继其他学者发现，珍珠层能够在体外实验环境中诱导成骨细胞增殖和矿化，进一步确定其成骨诱导性[3-5]。珍珠主要由珍珠层组成，比贝壳珍珠层含有更多的有机基质和微量元素[6]，并且产量丰富，引起了较多学者的关注，期望珍珠能有更好的成骨诱导性能。文章从珍珠层的理化特性、生物性能及成骨诱导方面展开综述。

1 珍珠层结构及包含成分

珍珠层具有典型的“砖-泥”结构，即文石板片呈层状分布，板片之间为有机质。对文石板片进一步观测发现，它的结构单元并不是一个完整的单晶，而是纳米晶粒的聚集体，晶粒周围都包裹有机基质，整个板片就是一个有机-无机复合的“伪单晶”[7]。显微结构下发现了文石板片中矿化桥的存在，位于文石板片层之间，表现为“砖-桥-泥”的结构，进一步认识了珍珠层结构[8]。Rousseau等[9]利用原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)观察到了这种纳米晶粒的存在，平均大小约45 nm。纳米颗粒被镶嵌到连续网状有机质框架中，并且每个纳米颗粒是独立的，相互间无直接接触；同时，通过高倍透射电子显微镜观测到了有机质桥的存在。文石晶型碳酸钙构成贝壳珍珠层和珍珠主要无机成分，约占总量的95%，还包含Na、K、Mg、Cu、Fe、Zn等多种微量元素[10]；有机成分近似5%主要为蛋白质。研究表明，珍珠层EDTA提取出的可溶蛋白质可以在体外实验中诱导文石和球文石晶体定向生成，并且具有相同多晶相和形态；而不可溶蛋白对晶体聚集密度、大小数量有影响[11]。学者们进一步从珍珠层中纯化分离出一些蛋白质，进行更深入的研究分析。多项研究表明它们能调控CaCO3沉积速度及表面形态，调节与钙离子结合状况[12-16]。P10这种蛋白在生物矿化中不仅加速碳酸钙晶体的成核，还促进碱性磷酸酶的活性，诱导成骨细胞分化[17]；P60作用于前成骨细胞和骨髓间质干细胞，促进矿化结节形成[18]；N16能诱导小鼠前成骨细胞分化及促进其生物矿化；抑制破骨细胞分化和骨组织吸收，对治疗骨质疏松有较大应用潜力[19]。

2 珍珠层生物相容性及降解性

众所周知，生物相容性是生物材料在组织工程中应用的基础条件。纳米珍珠粉细胞毒性试验相关结果表明符合生物材料的细胞毒性要求，未见溶血反应、内刺激反应及体内毒性反应,可以初步的认为纳米珍珠粉具有一定的血液和组织相容性[20]。有学者通过观测珍珠和贝壳珍珠层磨片，羟基磷灰石片(模拟体液沉积制作)对新生小鼠成骨细胞增殖和分化的作用，发现细胞在珍珠片上的增殖更快，细胞外基质面积最大[21]。Gao等[22]对比了纳米和微米珍珠粉生物利用率，表明纳米珍珠粉生物利用率效果更好。Chen等[23]研究表明口服纳米级珍珠粉未出现急性毒性反应，但长期慢性毒性反应有待于观测。

生物材料体内降解性能是评价生物材料安全性的重要指标。骨修复材料充填于骨缺损区，其体内生物降解速率应和新骨改建形成相适应。由于珍珠层仅含有1%～5%的有机质，而骨组织含有22%左右有机质，造成珍珠层的持续吸收速率低于骨吸收速率，珍珠层降解慢可能影响骨改建过程[24]。对于珍珠层降解，也有学者认为破骨细胞降解珍珠层种植体的能力有限，其中珍珠层种植体大小、由光滑到粗糙的形态及周围细胞环境是决定其生物降解的关键因素[25]。珍珠层粉粒径的大小也是影响其降解的关键因素之一，汤勇智等[26]发现，纳米级珍珠粉降解率高于微米级，骨修复能力也强于微米级。因此，珍珠层生物降解率与粒径大小和形态相关，当珍珠层的粒径逐渐变小，形态由光滑到粗糙，其降解吸收呈现上升的趋势。

3 珍珠层对前成骨细胞成骨诱导

珍珠层植入人、羊和大鼠体内均能刺激骨形成细胞，促进新骨形成，未发现炎症反应[3，27-28]。大量实验表明，珍珠层水溶有机质(water-soluble organic matrix，WSM)才具备实际意义上的成骨诱导性，不仅能促进小鼠前成骨细胞向成骨细胞分化，而且诱导其矿化成骨[27，29-30]。珍珠层水溶有机质含有约110种有机分子，分子量从100～700 Da不等，含有多肽氨基酸，分子量低于1 kD的有机分子是珍珠层水溶有机质主要组成部分[31]。为了进一步认识珍珠层有机基质中的成骨相关因子，Mouriès等[32]用高效液相色谱法根据有机基质分子量大小划分为SE1～SE4四段，其中相对分子量较小的SE4段成骨活性最明显，能够显著促进MCR5细胞的ALP活性，与骨形态蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)作用相似，不同细胞略有不同。Moutahir-Belqasmi等[33]将WSM配成不同的浓度：1 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL，研究对小鼠的成骨细胞作用，其中浓度为50 μg/mL的WSM对于ALP的增殖效果最好，100 μg/mL次之，余几乎没有影响，表明能促进细胞ALP增加的浓度为50～100 μg/mL。珍珠层水溶有机质对成骨有积极促进作用，同时对骨吸收也有影响，能促进前破骨细胞向破骨细胞分化，诱导破骨细胞吸收珍珠层基质，但吸收速度相比慢于骨的吸收，对破骨细胞有一定的抑制作用[34-35]。虽然珍珠层水溶有机质表现出良好的促成骨效应和破骨调控作用，但它毕竟是一种混合物，包含多种分子，珍珠层水溶有机质良好性能可能是多种分子共同作用的结果。

4 珍珠层对骨髓间充质干细胞成骨诱导及相关应用

珍珠层对前成骨细胞的体内外实验均表明，WSM能释放相关信号因子促进细胞成骨分化。有学者推测WSM信号因子也能影响骨髓间充质干细胞，使其向成骨细胞分化。在1999年Lamghari等[36]研究发现WSM在1.6 mg/mL时，大鼠骨髓间充质干细胞(rats bone marrow mesenchymal cells，rBMSCs) ALP活性明显提高，同时在830 g/mL降低细胞增殖率，说明较高浓度WSM才能促进ALP活性增加，作用类似于BMPs。随着研究进展，低浓度WSM及特定提取蛋白也表现出促成骨作用。Mouriès等[32]发现WSM在135 g/mL、270 g/mL和540 g/mL均增强骨髓间充质干细胞ALP活性，作用与地塞米松作用相似，同时能促进细胞增殖并且没有表现出剂量相关性，而地塞米松对增殖几乎没有影响。也有研究表明WSM能影响相关成骨相关信号因子，尤其是在150～200 μg/mL时BMP-2的基因表达量增强，成骨诱导作用明显，表现为兔BMSCs中碱性磷酸酶的活性提高，成骨细胞分化增强[37]。珍珠层提取蛋白P60能促进MC3T3-E1细胞和MSCs细胞周围矿化结节的产生，在第8天左右均开始矿化，MSCs细胞矿化程度弱于MC3T3-E1细胞[18]。Green等[38]研究发现珍珠层片(500～750 μm)与人骨髓间充质干细胞共培养，比rhBMP-2的成骨诱导性更强；EDTA提取的珍珠层可溶基质蛋白(nacre soluble protein matrix，SPM)尤其富含酸性天冬氨酸，具有良好的成骨诱导性，并能促进细胞增殖及骨钙素的表达。

5 展望

珍珠层具有有机和无机完美结合的生物矿化结构，尤其是有机基质包含促进骨形成和骨改建主要信号因子，使珍珠层具有良好的成骨诱导潜能。大量实验对珍珠层作为骨替代材料展开了深入研究，尤其是对前成骨细胞和髓间质干细胞的成骨诱导，但是珍珠层诱导成骨机制目前还没有明确阐明。虽然相关文献报道成骨因子存在于小分子量有机基质中，但具体调控因子及相关通路未完全明确，有待于进一步深入研究。珍珠层作为复合材料应用在复合支架材料中，能复合PLLA、PLGA、生物凝胶[39-41]等，表现出良好的生物相容性和安全性，具有可观应用前景。珍珠层各方面的优良性能也展现了珍珠应用潜力，尤其是纳米级珍珠粉，期待进一步的深入研究。

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R68

A

1003—6350（2017）11—1836—03

2016-12-06)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.11.038

海南省重点研发项目（编号：ZDYF2016018）；海南省海口市重点科技计划项目-2013-58（编号：2013-SKG-06023）

徐普。E-mail：hnxupu@163.com