Lin28B/let-7d环路调控成纤维细胞功能参与肺纤维化发生

梁海海, 李天宇, 解 岩，单宏丽

(1.哈尔滨医科大学药学院药理学教研室，省部共建生物医药重点实验室培育基地，心血管药物研究教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081；2.哈尔滨医科大学大庆校区基础医学院生理学教研室，黑龙江 大庆 163319)

Lin28B/let-7d环路调控成纤维细胞功能参与肺纤维化发生

梁海海1, 李天宇1, 解 岩2，单宏丽1

(1.哈尔滨医科大学药学院药理学教研室，省部共建生物医药重点实验室培育基地，心血管药物研究教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081；2.哈尔滨医科大学大庆校区基础医学院生理学教研室，黑龙江 大庆 163319)

目的 研究Lin28B/let-7d环路诱导肺成纤维细胞增殖、分化的作用及分子机制，为临床肺纤维化的治疗提供新的策略。方法 气管注射博来霉素(bleomycin，BLM)造成小鼠肺纤维化模型；血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)及转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)纤维性变；qRT-PCR检测组织及细胞中Lin28B、collagen 1α1、collagen 3α1变化；Western blot检测Lin28B蛋白表达；MTT、Edu染色和免疫荧光实验分别检测细胞活力、增殖及成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变。结果 Lin28B在肺纤维化小鼠和细胞中表达明显升高。Lin28B可诱导MRC-5细胞胶原合成增加，而过表达let-7d则减轻Lin28B的这一作用。进一步研究发现，Lin28B可诱导成纤维细胞增殖，并促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转变，这一作用是通过抑制let-7d来实现的。结论 Lin-28B通过抑制let-7d进而促进成纤维细胞增殖、分化，最终增加成纤维细胞胶原合成，诱发肺纤维化的发生，Lin28B可能作为肺纤维化的治疗新靶点。

肺纤维化；Lin28B；let-7d；MRC-5细胞；肌成纤维细胞；细胞增殖

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) 是一种病因不明、发病机制不清的致死性弥漫性肺间质疾病，IPF是间质性肺炎中发病率最高、最常见、预后最差的疾病，其5年生存率不超过50%，严重危害着人类健康[1]。因此，探索其发病机制，寻找新的治疗靶点是目前本领域研究的热点难点问题。

微小核苷酸(microRNAs, miRNAs)是一类长度约19～22个碱基的非编码RNA分子，其可通过作用于目的基因的3′-非编码区(3′-untranslated region，3′-UTR)进而抑制目的基因翻译或直接使其降解[2]。已有研究证实，多个miRNAs参与肺纤维化的发生、发展过程。Let-7d是第一个被证实参与肺纤维化发生的miRNA[3]，研究表明，let-7d可通过调控肺泡上皮细胞和肺成纤维细胞，进而抑制肺纤维化的发生，但是其上游调控机制尚不清楚。

RNA结合蛋白Lin28B可通过抑制let-7进而发挥促肿瘤作用[4]。本课题组以往研究发现，Lin28B可通过抑制let-7d，诱导肺泡上皮细胞转变为肌成纤维细胞，进而增加细胞胶原合成，诱发肺纤维化的发生[5]。但其对成纤维细胞的作用尚未阐明。本研究旨在研究Lin28B/let-7d对成纤维细胞的作用，并探讨其分子机制，以期为肺纤维化的治疗及药物研发提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人胚肺成纤维细胞(MRC-5细胞)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 试剂 博来霉素(bleomycin, BLM)购自Merck Millipore公司；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司；Lin28B-TAT购自Pepro Tech公司；实验所用抗体(Lin28B、α-SMA)均购自Abcam公司；DMEM、胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶购自Gibco公司；let-7d及阴性对照序列(NC)购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；蛋白提取及免疫印迹试剂购自北京碧云天生物技术研究所；RNA提取及定量PCR所需试剂购自美国Applied Biosystems公司；Edu细胞增殖试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司。

1.1.3 仪器 荧光显微镜购自Olympus公司；酶标仪购自Tecan公司；电泳仪/转膜仪购自Bio-Rad公司；Odyssey双色红外激光成像系统购自LICOR公司；qRT-PCR仪购自Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 肺纤维化小鼠模型构建 健康8周龄C57BL/6小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，用1%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，将小鼠仰位固定于鼠板，75%酒精消毒后，暴露气管。将小鼠随机分为2组：注射生理盐水组(Saline)及注射博来霉素组(BLM)，将BLM或Saline注射于小鼠气管内，按5 mg·kg-1体质量或50 μL·30 g-1体质量。28 d后形成肺纤维化模型。

1.2.2 细胞培养 MRC-5细胞于含10% FBS的DMEM培养液中，置于5% CO2培养箱中培养，实验时，接种细胞密度为2.0×108·L-1，细胞于培养板内贴壁后，给予1 μmol·L-1Ang Ⅱ或20 μg·L-1的Lin28B-TAT处理，同时，按照Lipo2000说明书转染let-7d及NC，48 h后进行后续实验。

1.2.3 Western blot 将组织或细胞加入裂解液裂解，超声破碎，离心，取上清， BCA 法进行蛋白定量。将60 μg蛋白与5×上样缓冲液混合均匀，100℃样品变性5 min，快速置冰上1 min。电泳后70 V恒压转膜110 min。室温封闭2 h，PBS 洗去封闭液，一抗4 ℃过夜，然后用红外荧光标记二抗避光孵育1 h，以上过程均需避光。

1.2.4 qRT-PCR 使用TRIzol法提取细胞总RNA，并用随机引物逆转录为cDNA，根据Applied Biosystems的扩增试剂盒进行定量PCR检测，目的基因量=2-△△CT计算目的基因相对含量。

1.2.5 细胞增殖活力检测 将MRC-5细胞接种于96孔培养板中，体系为180 μL，加入不同处理因素，培养48 h后，每孔加入20 μL 5 g·L-1的MTT溶液,充分混匀后继续培养4 h，弃去上清，每孔加入150 μL DMSO，震荡使沉淀充分溶解，酶标仪测各孔吸光度值。

1.2.6 EdU染色法检测细胞增殖 将MRC-5细胞接种于盖玻片上，于12孔板内培养，经过不同因素处理48 h后，弃去培养液，按照试剂盒说明书进行染色，最后于荧光显微镜下观察细胞。

1.2.7 细胞免疫荧光化学 将MRC-5细胞接种于盖玻片上，于12孔板内培养，经过不同因素处理48 h后，弃去培养液，用PBS轻轻冲洗3遍，加500 μL 4%多聚甲醛，37℃、10 min固定细胞，弃去多聚甲醛，用0.1 mol·L-1PBS轻轻冲洗细胞3次；加入500 μL穿透液(1 mL PBS+4 μL Triton+0.01 g BSA)，室温孵育1 h，弃去穿透液，用PBS冲洗细胞3次，加入1 mL封闭用山羊血清，37 ℃，封闭1 h，回收山羊血清，用PBS洗细胞3次，加入α-SMA一抗，4 ℃过夜，次日用PBS洗细胞3次；加入荧光标记的二抗，室温孵育1 h，回收二抗，用PBS洗细胞3次；加入DAPI染色细胞核，室温染色5 min，PBS洗3次，于荧光显微镜下观察细胞。

2 结果

2.1 Lin28B在肺纤维化中表达升高 为了明确Lin28B在肺纤维化中的作用，我们通过气管注射BLM构建小鼠肺纤维化模型，4周后取材，通过qRT-PCR及Western blot检测发现，与注射生理盐水组小鼠相比，注射BLM组小鼠肺组织中Lin28B的mRNA和蛋白水平均明显升高(Fig 1A、1B)。为进一步明确Lin28B在肺纤维化中的变化，我们使用血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)处理MRC-5细胞，如Fig 1C和1D所示，Ang Ⅱ处理48 h后，MRC-5细胞中Lin28B表达水平明显增加。同时，使用TGF-β1处理MRC-5细胞后，Lin28B表达亦明显升高(Fig 1E、1F)。以上结果提示，Lin28B可能参与肺纤维化的发生。

2.2 Lin28B通过抑制let-7d增加肺成纤维细胞胶原生成 为进一步明确Lin28B对肺纤维化的作用，我们使用Lin28B-TAT 处理MRC-5细胞，并转染let-7d。如Fig 2所示，Lin28B能明显增加MRC-5细胞中胶原合成，而过表达let-7d则可减轻Lin28B所诱导的胶原合成。Lin28B可能通过抑制let-7d，进而调控成纤维细胞功能，最终参与肺纤维化的发生。

2.3 Lin28B/let-7d环路促进成纤维细胞增殖 在肺纤维化的发生过程中，成纤维细胞的增殖和肌成纤维细胞的生成是造成细胞外基质异常沉积的直接原因。为了探究Lin28B/let-7d环路参与肺纤维化的细胞机制，我们首先检测Lin28B/let-7d环路对肺成纤维细胞增殖的作用。结果如Fig 3所示，Lin28B可促进成纤维细胞增殖，而过表达let-7d则明显抑制Lin28B诱导的细胞增殖，表明Lin28B/let-7d环路可通过促进成纤维细胞增殖，进而参与肺纤维化的发生。

2.4 Lin28B/let-7d环路诱导肌成纤维细胞生成 α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin, α-SMA)被认为是肌成纤维细胞的标志性蛋白，我们通过α-SMA染色证实，Lin28B/let-7d环路可诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转换，进而促进肌成纤维细胞生成，诱导肺纤维化(Fig 4)。

3 讨论

IPF的病理改变以肺泡上皮损伤、炎性细胞蓄积、成纤维细胞增殖以及细胞外基质的异常沉积为主要特征，这个过程最终引起肺弹性和肺泡表面积的丧失，进而导致气体交换和肺功能的损害。肌成纤维细胞是诱发IPF的主要效应细胞，肌成纤维细胞同时具有成纤维细胞和平滑肌细胞的特点，并且大量合成、分泌细胞外基质[6]。肺部肌成纤维细胞有多种来源，包括成纤维细胞、上皮细胞、骨髓源性循环成纤维细胞等，其中上皮细胞和成纤维细胞被认为是肌成纤维细胞的主要来源[7]。因此，通过调控上皮细胞及成纤维细胞，干扰肌成纤维细胞的生成是治疗IPF的重要方向

Fig 1 Lin28B incerased in lung fibrosis(n=5) qRT-PCR(A) and Western blot(B) detected the alteration of Lin28B in the lung of mice after treatment with BLM; C-D: Lin28B was up-regulated in MRC-5 cells treated by Ang Ⅱ; E-F: Lin28B was increased in MRC-5 cells treated by TGF-β1.*P<0.05,**P<0.01vssaline or control

Fig 2 Lin28B promoted collagen synthesis in MRC-5 cells(n=4)

A: Lin28B increased the expression of collagen 1α1 at mRNA level; B: Lin28B increased the expression of collagen 3α1 at mRNA level.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsLin28B

。

Let-7d是第一个被证实在IPF中发挥调节作用的miRNA。Pandit等[3]利用miRNA芯片技术分析了IPF患者和正常肺组织，发现IPF患者肺组织中包括let-7d在内的18个miRNAs表达明显下调。在体外实验中，肺泡上皮细胞A549经TGF-β1刺激后，let-7d表达量减少，而HMGA2表达量增加，进一步研究证实TGF-β1通过Smad3与let-7d启动子结合，抑制let-7d表达。同时，特异性抑制小鼠肺组织中let-7d可诱导上皮间质转化，使肺泡壁增厚，最终导致肺纤维化。此外，研究还发现，let-7d可以通过影响肺成纤维细胞的形态及功能，进而调控肺纤维化的发生[8]。然而，关于let-7d的上游调控机制尚不清楚。

Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白，其包括2个同源基因，Lin28A和Lin28B。研究显示，Lin28可以抑制let-7的成熟过程，而let-7亦可以通过结合在Lin28的3′-非编码区，进而抑制Lin28表达[9]。已有研究证实，Lin28/let-7d反馈环路参与多种病理生理学过程，包括胚胎发育、干细胞功能的调节及肿瘤的发生[4,10-12]。Zhang等[10]研究表明，过表达Lin28A或者Lin28B可以增强NANOG、OCT4及SOX2诱导多能干细胞的重编程效率。Albino等[4]研究发现，Lin28通过下调let-7进而促进肿瘤干细胞的生成及前列腺癌的发生。

Fig 3 Lin28B/let-7d axis induced fibrogenesis in MRC-5 cells (n=6)

A: Lin28B/let-7d axis increased cell viability in MRC-5 cells; B: Lin28B /let-7d axis promoted proliferation of MRC-5 cells.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLin28B

然而，Lin28B/let-7d环路是否参与肺纤维化的发生？Lin28是否可以通过调控let-7d进而诱导肺纤维化？Lin28B是否可以作为肺纤维化的治疗新靶点？目前均不清楚。我们前期研究发现，Lin28B在肺纤维化小鼠和IPF肺组织中表达明显升高，同时，Lin28B通过抑制let-7d表达进而诱导上皮间质转化和细胞纤维性变；反之，特异性敲除Lin28B可以减轻TGF-β1诱导的上皮间质转化及肺纤维化[5]。

我们前期研究发现，miRNA-26a可通过转录后抑制HMGA2，从而抑制上皮间质转化及EMT的发生[13]。此外，miR-21、miR-9等多个miRNAs均被证实参与肺纤维化的病理进程[14-15]，且多个miRNAs参与肺泡上皮细胞和成纤维细胞功能的调控[16]。那么，这些miRNAs之间有何内在联系？在近期的一项研究工作中，我们发现miR-26a可以通过靶向Lin28B增加let-7d表达水平，提示miR-26a与let-7d具有协同治疗肺纤维化的作用[5]。在此基础上，我们构建了肺纤维化中miRNAs-TF-miRNAs调控网络，揭示了肺纤维化中miRNAs之间直接的相互调控关系。然而，不同miRNAs之间的确切调控关系，还有待我们进一步的探究和验证。

那么，作为肺纤维化中肌成纤维细胞的另外一个重要来源，Lin28B是否可以通过调控let-7d影响肺成纤维细胞形态及功能，进而参与肺纤维化发生？

Fig 4 Lin28B /let-7d axis provoked fibroblasts-to-myofibroblasts transition

在本研究工作中，我们发现，Lin28B在发生纤维性变的肺成纤维细胞中表达明显升高，同时证实，Lin28B通过抑制let-7d表达，进而诱导肺成纤维细胞增殖，并促进肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转变，最终促进胶原生成。结合之前的研究工作[5]，我们推断，靶向抑制Lin28B可能通过减轻上皮间质转化及肺成纤维细胞形态改变，进而抑制肺纤维化的发生，Lin28B/let-7d反馈环路可作为肺纤维化的治疗新靶点。

(致谢：本实验在哈尔滨医科大学药学院药理学教研室单宏丽课题组实验室完成。)

[1] Daccord C, Maher T M. Recent advances in understanding idiopathic pulmonary fibrosis[J].F1000Res, 2016, 5.pii: F1000 Faculty Rev-1046.

[2] Ambros V. microRNAs: tiny regulators with great potential[J].Cell, 2001, 107(7):823-6.

[3] Pandit K V, Corcoran D, Yousef H, et al. Inhibition and role of let-7d in idiopathic pulmonary fibrosis[J].AmJRespirCritCareMed,2010,182(2):220-9.

[4] Albino D, Civenni G, Dallavalle C, et al. Activation of the Lin28/let-7 axis by loss of ESE3/EHF promotes a tumorigenic and stem-like phenotype in prostate cancer[J].CancerRes, 2016, 76(12):3629-43.

[5] Liang H, Liu S, Chen Y, et al. miR-26a suppresses EMT by disrupting the Lin28B/let-7d axis: potential cross-talks among miRNAs in IPF[J].JMolMed(Berl), 2016, 94(6):655-65.

[6] Liang H, Xu C, Pan Z, et al. The antifibrotic effects and mechanisms of microRNA-26a action in idiopathic pulmonary fibrosis[J].MolTher, 2014, 22(6):1122-33.

[7] Hinz B, Phan S H, Thannickal V J, et al. The myofibroblast: one function, multiple origins[J].AmJPathol, 2007, 170(6):1807-16.

[8] Huleihel L, Ben-Yehudah A, Milosevic J, et al. Let-7d microRNA affects mesenchymal phenotypic properties of lung fibroblasts[J].AmJPhysiolLungCellMolPhysiol, 2014, 306(6):L534-42.

[9] Desjardins A, Bouvette J, Legault P. Stepwise assembly of multiple Lin28 proteins on the terminal loop of let-7 miRNA precursors[J].NucleicAcidsRes, 2014, 42(7):4615-28.

[10]Zhang J, Ratanasirintrawoot S, Chandrasekaran S, et al. Lin28 regulates stem cell metabolism and conversion to primed pluripotency[J].CellStemCell, 2016, 19(1):66-80.

[11]McDaniel K, Hall C, Sato K, et al. Lin28 and let-7: roles and regulation in liver diseases[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol, 2016, 310(10):G757-65.

[12]Takashima Y, Terada M, Udono M, et al. Suppression of lethal-7b and miR-125a/b maturation by Lin28b enables maintenance of stem cell properties in hepatoblasts[J].Hepatology, 2016, 64(1):245-60.

[13]Liang H, Gu Y, Li T, et al. Integrated analyses identify the involvement of microRNA-26a in epithelial-mesenchymal transition during idiopathic pulmonary fibrosis[J].CellDeathDis, 2014, 5:e1238.

[14]Fierro-Fernandez M, Busnadiego O, Sandoval P, et al. miR-9-5p suppresses pro-fibrogenic transformation of fibroblasts and prevents organ fibrosis by targeting NOX4 and TGFBR2[J].EMBORep, 2015, 16(10):1358-77.

[15]Liu G, Friggeri A, Yang Y, et al. miR-21 mediates fibrogenic activation of pulmonary fibroblasts and lung fibrosis[J].JExpMed, 2010, 207(8):1589-97.

[16]刘晓丽，王如峰，胡秀华. MicroRNAs在呼吸系统疾病预防和治疗中的研究进展[J].中国药理学通报，2015，31(7)：895-9.

[16]Liu X L, Wang R F, Hu X H. Advanced study on microRNAs involved in prevention and treatment of respiratory system diseases[J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(7):895-9.

Lin28B/let-7d axis contributes to pulmonary fibrosis by affecting mesenchymal phenotypic properties of lung fibroblasts

LIANG Hai-hai1, LI Tian-yu1, XIE Yan2, SHAN Hong-li1

(1.DeptofPharmacology,CollegeofPharmacy,HarbinMedicalUniversity,State-ProvinceKeyLaboratoriesofBiomedicine-PharmaceuticsofChina,KeyLaboratoryofCardiovascularResearch,MinistryofEducation,Harbin150081,China; 2.DeptofPhysiology,HarbinMedicalUniversity-Daqing,DaqingHelongjiang163319,China)

Aim To examine the role and uderlying mechanisms of Lin28/let-7d axis in the proliferation of lung fibrobalsts and fibroblasts-into-myfibroblasts transition, and provide novel strategy for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis(IPF). Methods We induced experimental lung fibrosis in mice by intratracheally injection of bleomycin(BLM). Ang Ⅱ and TGF-β1 were used to induce fibrogenesis in cultured MRC-5 cells;qRT-PCR and Western blot were applied to determine the changes of Lin28B, collagen 1α1 and collagen 3α1; MTT assay, Edu satining and immunofluoresence were used to examine the cell viability, proliferation and fibroblasts-into-myofibroblasts transition in MRC-5 cells. Results Lin28B was increased in the lung of mice with experimental lung fibrosis and in MRC-5 cells treated with AngⅡ or TGF-β1. Moreover, Lin28B enhanced collagen deposition via inhibiting expression of let-7d, which maybe contribute to the progression of IPF. In addition, further studies showed that Lin28B promoted proliferation and fibroblasts-into-myofibroblasts in MRC-5 cells. Conclusion Lin28B/let-7d axis contributes to fibrogenesis via promotes fibroblasts-into-myofibroblasts transition, which may provide novel approaches for lung fibrosis treatment.

pulmonary fibrosis; Lin28B; let-7d; MRC-5 cell; myofibroblasts; cell proliferation

时间：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.014.html

2016-09-15,

2016-10-25

黑龙江省教育厅科学技术研究资助项目(No 12541362)

梁海海(1984-)，男，博士，副教授，研究方向：心肺系统药理学，E-mail: lianghaihai@ems.hrbmu.edu.cn; 单宏丽(1972-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：心血管药理学，通讯作者，E-mail: shanhongli@ems.hrbmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.007

A

1001-1978(2017)02-0175-06

R-332；R322.35；R329.24；R563.1302.2