参麦注射液主要成分与卒中关联的网络药理作用机制和实验验证

吕燕妮, 付龙生, 周 健，潘晓林，陈璿瑛，万 青

(南昌大学第一附属医院药学部，江西 南昌 330006)

参麦注射液主要成分与卒中关联的网络药理作用机制和实验验证

吕燕妮, 付龙生, 周 健，潘晓林，陈璿瑛，万 青

(南昌大学第一附属医院药学部，江西 南昌 330006)

Network pharmacological mechanism of main components of Shenmai injection related with stroke and experimental verification

LYU Yan-ni, FU Long-sheng, ZHOU Jian, PAN Xiao-lin, CHEN Xuan-ying, WAN Qing

(DeptofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

网络药理学; 参麦注射液; 卒中; 作用机制; 信号通路; 脑缺血/再灌注损伤

network pharmacology; Shenmai injection; stroke: action mechanism; signaling pathway; cerebral ischemia/reperfusion injury

参麦注射液是传统中药红参与麦冬的复方制剂，具有益气固脱、养阴生津、生脉等功效。除对心脏和免疫功能疾病的防治外，对缺血性卒中也有明显疗效，其可协同降压药、溶栓药等西药，改善脑缺血预后。两味主药中，红参可保护血管内皮细胞，抗脂质过氧化和清除自由基，麦冬亦可通过保护血管内皮细胞，增强免疫力和耐缺氧能力。然而，由于化学成分的复杂性和功能主治的多样性，其与缺血性卒中关联的作用机制仍不明确， 仍停留在整体动物指标，缺乏深入的分子生物学水平，尤其缺乏分子信号通路水平研究，其更能有效地作为生物标记物反映药理效应和作用机制的变化。本研究通过网络药理学[1-2]与实验验证等方法，挖掘参麦注射液中主要成分与缺血性卒中间的关联，阐释其与临床疗效相关的分子机制，有利于加强中药基础与临床研究的沟通，更好地服务于临床。

1 材料与方法

1.1 文本挖掘 在 TCMGeneDIT系统中，以两味主药红参、麦冬中的20个成分为研究对象(其中鲁司可皂苷元和薯蓣皂苷元以这2个皂苷元的英文名为搜索词)，搜索条件的阈值为大于概率0.95，以自动文本挖掘方式搜索与化合物相互作用的蛋白信息。同样在Agilent Literature Search中，以人参和麦冬英文名进行搜索，对TCMGeneDIT数据库中的蛋白信息进行补充。

1.2 反向对接 在Pharmmapper数据库中，以成分的mol2格式输入search栏中，设置参数为不选择构象变化，其余设置参数为默认选项，截断值为2.0，选择人类数据库，产生默认的300个构象后，按照打分最终选取50个蛋白构象。将反向对接产生的构象与“1.1”节中文本挖掘所产生的构象，合并为参麦注射液作用蛋白集。

1.3 参麦注射液多成分-蛋白网络与信号通路的映射 在Genecards数据库中，以stroke进行搜索，搜索出与stroke相关联的2 494个蛋白，与“1.2”节中蛋白集进行交集，最终得参麦注射液化合物相互作用蛋白群。以相互作用蛋白群中的蛋白名为检索词，从Genecards、BIND、BioGRID、IntAct、MINT等数据库中，建立蛋白关联词条，Cytoscape中建立蛋白相互作用网络。ClusterONE插件提取具有显著性差异(P<0.05)的子网络，并将网络中关键蛋白进行Biocart信号通路映射。

1.4 小鼠局灶性中动脉梗死(MCAO)模型制备及参麦注射液给药 C57BL/6J小鼠，体质量18～22 g，扬州大学比较医学中心提供。参麦注射液(正大青春宝药业有限公司)。术前1 h参麦注射液5 mL·kg-1腹腔注射。

1.5 Western blot法与统计学分析 Western blot法检测小鼠皮层边缘组织p38、ERK1、ERK2、IKKα、IKKβ表达(抗体1 ∶1 000稀释)。实验数据用Graphpad Prism 5.0统计软件进行单因变量多因素方差分析。

2 结果

2.1 参麦注射液主要成分-蛋白网络的分析 参麦注射液的20个成分，共作用于61个蛋白，参麦注射液多成分蛋白网络平均Degree为4.165，其中14个成分其连接度达到5以上，人参皂苷与全部蛋白网络中的蛋白均有相互作用。2个麦冬皂苷元成分与CASP3、CHUK、HSAP90AA1、MAPK1、MAPK14、NFKB1 6个蛋白有相互作用，这6个蛋白在网络中 占据高连接度，对网络健康度有极大影响。

2.2 蛋白相互作用网络的分析 60个蛋白构成无孤立结点的蛋白相互作用网络，提取差异有显著性(P<0.01)的子网络1个，子网络中含有关键蛋白19 个(Tab 1)，在Biaocart信号通路上映射及富集分析(Tab 2)，涉及MAPK、NF-κB、AKT与Toll样受体等信号通路。

2.3 关键蛋白和信号通路的验证 MAPK信号通路是富集指数P最小的信号通路，是参麦注射液作用于MCAO模型最有可能的潜在信号通路，与MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14蛋白所调控的MAPK受体及信号通路变化一致。参麦注射液干预后，对MCAO模型中上调的p38、ERK1、IKKβ的磷酸化表达有明显下调作用(P<0.01)。

Tab 1 Protein interaction network with significant difference extracted via ClusterONE (protein represented using its gene name)

Tab 2 Biaocart signaling pathways mapped on protein interaction network with significant difference

3 讨论

本研究中，参麦注射液主要成分蛋白网络平均Degree为4.165，不仅表明中药多成分、多靶点的特点，同时也说明参麦注射液主要成分对网络的健康度影响较大。麦冬皂苷作用于含6个蛋白的子网络，剔除这6个蛋白后，网络度由4.165下降到2.332，平均蛋白连接度下降1.833，表明麦冬皂苷虽然作用的蛋白较少，但是能够作用于网络的关键蛋白结点。

参麦注射液主要成分作用的蛋白包括丝氨酸/苏氨酸激酶AKT、PI3K蛋白、丝裂原激酶蛋白家族、热休克蛋白90、Toll样受体4等，其参与炎症反应、细胞代谢与细胞免疫等作用。而作用的主要信号通路中，p38MAPK信号通路可调节脑中水通道蛋白9的表达，调节局部脑缺血[3]。AKT-GSK3-CREB信号通路参与提高脑缺血后脑源性神经营养因子BDNF表达，保护脑缺血[4]。Toll 4受体所代表的Toll信号通路，可作用于HMGB-1，参与脑缺血/再灌注作用[5]。NF-κB和TNF信号通路所代表的经典炎症通路[6]，参与炎症因子的释放，与缺血性卒中的机制密切相关。参麦注射液干预MCAO模型后，p38、ERK1和IKKβ的表达降低，证实了网络药理学可为实验验证提供先导信息，初步揭示其防治疾病的分子机制，为进一步实验研究奠定科学基础。

(致谢：本实验于南昌大学第一附属医院科研平台实验室完成。感谢实验室老师与全体同学的大力帮助！)

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时间：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.058.html

2016-10-12，

2016-11-10

江西省卫生厅中医课题资助(No 2014A04)

吕燕妮(1986-), 女，博士，主管药师, 研究方向：临床药理学和药物不良反应监测,通讯作者，E-mail：lvyanni@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.029

A

1001-1978(2017)02-0293-02

R-332；R282.71；R284.1；R329.25；R743.310.22