非结核分枝杆菌病实验室诊断技术及药敏试验研究进展

郭明日,张丽霞

·综述·

非结核分枝杆菌病实验室诊断技术及药敏试验研究进展

郭明日1,2,张丽霞1,2

非结核分枝杆菌病； 药敏试验； 诊断； 综述

非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)是指结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。随着结核病疫情的有效控制，新的诊断技术水平不断提高，更多的NTM感染被鉴定出，人们也重新认识到NTM感染的重要性，确认了NTM可感染肺部、皮肤、骨骼、淋巴结等组织和器官，由此导致相应部位的非结核分枝杆菌病发生。我国2010年第五次全国结核病流行病学调查报告显示NTM分离率明显增加，从1990年的4.9%上升到2000年的11.1%，2010年的22.9%[1]，这表明我国的NTM感染率有明显上升的趋势。本文对NTM实验室诊断技术以及NTM药敏试验方面的研究和应用作一综述如下。

1 NTM的分类

迄今为止，已报道的非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)菌种有160余种，13个亚种，且种类仍在逐渐增加中[2]。伯杰系统细菌学手册根据NTM的生长速度将其分为快速生长型和缓慢生长型，常见的快速生长分枝杆菌29种，缓慢生长分枝杆菌26种，其他分枝杆菌及亚种120余种[1],其中致病或条件致病菌种有50余种。Runyon分类法将NTM分为四群:Ⅰ群：光产色分枝杆菌，如猿猴分枝杆菌(M.simiae)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)等；Ⅱ群：暗产色分枝杆菌，如苏加分枝杆菌(M.szulgal)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)；Ⅲ群：不产色分枝杆菌，如鸟分枝杆菌复合群、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、土地分枝杆菌(M.terrae)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)；Ⅳ群：快生长分枝杆菌,在3～5 d内有肉眼可见的菌落，如偶然分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)。

2 NTM病的实验室诊断技术

NTM病的确诊有赖于实验室检测出患者临床标本中存在非结核分枝杆菌，抗酸染色法无法鉴别NTM与结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis,MTB)，因此需要对分枝杆菌进行菌种鉴定。本文综述了NTM鉴定的传统方法和目前常用的几种分子生物学鉴定方法。

2.1 NTM鉴定的传统方法 经抗酸染色镜检确定是抗酸菌的阳性菌株，接种于改良罗氏(L-J)培养基进行增菌传代。采用对硝基苯甲酸(PNB)生长试验、28℃生长试验、耐热触酶试验、观察细菌生长速度、菌落形态和颜色确定属于MTB或者NTM[1]。首先根据生长速度确定属于快速生长分枝杆菌(≤7 d)或缓慢生长分枝杆菌(>7d)；根据PNB(500 μg/ml)生长试验区分为MTB(PNB培养基生长受抑制)或NTM(大多数NTM在一定浓度的PNB培养基有耐受性，可以生长)；此外，结合28℃生长试验(MTB不生长，NTM可以生长)、耐热触酶试验(MTB在68℃水浴20 min后不能分解过氧化氢，NTM则仍可分解过氧化氢而产生持续性小气泡)也可对MTB和NTM进行初步鉴定。

2.2 核酸测序鉴定 核酸测序技术基于同源基因或序列的差异来进行菌种鉴定，是目前分枝杆菌鉴定技术中分辨率最高、结果最为可靠的技术。16S rRNA基因测序分析是分枝杆菌菌种鉴定的标准方法，但是由于一些NTM菌种在16S rRNA基因序列上非常相近甚至相同[3]，该基因序列在分枝杆菌属内的不同种之间多态性很低，因此，最近几年已经发展起采用分枝杆菌属的16S rRNA，16S～23S rRNA内转录间隔序列(internal transcribed spacer sequences,ITS)为靶基因进行测序鉴定，其多态性明显高于单独采用16S rRNA基因测序[4]，根据测序结果与NCBI数据库进行BLAST比对得出菌种鉴定结果。YU等[4]在中国西南地区采用16S rRNA，16S～23S rRNA内转录间隔序列基因为靶基因进行NTM测序鉴定，发现中国西南地区常见的NTM菌种依次为鸟-胞内分枝杆菌(35.6%)、龟-脓肿分枝杆菌(32.6%)、偶然分枝杆菌(10.8%)、戈登分枝杆菌(5.9%)、堪萨斯分枝杆菌(1.9%)等，此外还首次在中国西南地区发现了1株Tsukamurella分枝杆菌。因此，16S rRNA和ITS序列作为菌种基因分型的一种辅助方法，为疑似NTM感染人群的诊断提供了一种新的策略与手段。

2.3 基因芯片鉴定 基因芯片技术采用DNA探针固化于支持物表面，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号而对样品中的核酸进行快速、高通量检测。目前市场上采用较多的是北京博奥生物公司推出的菌种鉴定试剂盒，可定性检测疑似结核病或NTM病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株或直接来源于疑似患者的临床样本中的核酸，可鉴定常见的17个种或群，包括MTB、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、龟/脓肿、草、不产色、海、溃疡、金色、苏尔加和玛尔摩、蟾蜍、耻垢分枝杆菌，可用于MTB和NTM病的辅助诊断。其基本原理是将DNA探针固化于支持物表明，产生二维DNA探针阵列，与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号实现对生物样品快速、并行、高通量检测。国内已有多篇文献[5-7]报道了基因芯片法鉴定NTM菌种的临床应用情况，该方法可在6～8 h内出具菌种鉴定结果，为患者得到合理化治疗提供及时、准确的实验室依据。

2.4 PCR-荧光探针法 本方法采用双重实时荧光PCR技术和TaqMan探针技术实现对分枝杆菌的检测，分别针对结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌的特异性序列设计引物和探针，两个探针分别标记不同的荧光发光基团，通过检测不同荧光通道的荧光信号变化来区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。有文献显示[8]采用PCR-荧光探针法对疑为结核病的石蜡包埋组织检测结核分枝杆菌/非结核分枝杆菌，PCR-荧光探针法的阳性率51.50%高于抗酸染色法的31.00%和金胺O染色法的40.5%，有较高的敏感性和准确性，可用于结核病/非结核分枝杆菌病的鉴别诊断。梁建琴等[9]使用该方法检测1015例痰液，对于检出的11例NTM核酸进行16S rRNA测序确认，准确率100%；56株分离株样本(1株MTB分离株，55株NTM分离株)检测，准确率100%。不过由于该检测方法目前只能区分MTB和常见的NTM菌种，因此，存在一定的漏诊风险。此外，如果样本中混合有MTB和NTM时，仅能报告MTB核酸检测阳性，且不能鉴定NTM的菌种。

2.5 线性探针杂交法鉴定 线性探针杂交法是将PCR扩增、反向杂交、酶显色技术合为一体，特异性引物扩增目的基因片段，扩增产物与膜上固定的特异性探针杂交，通过酶显色反应判读结果。MTB的鉴定基于gyrB基因的SNPs和BCG的结核分枝杆菌基因组差异区1(region of difference,RD1)区域的差异，而NTM的鉴定是基于23S rRNA基因差异片段序列。目前德国Hain Lifescience公司生产的GenoType Mycobacterium CM/AS可以鉴定31种常见的NTM菌种，其中CM试剂盒可鉴定出15种常见的分枝杆菌菌种，AS可以鉴定出16种常见的非结核分枝杆菌菌种。检测的样本类型为临床疑似结核病和NTM病患者经过分离培养的分离株。Sookan等[10]利用GenoType Mycobacterium CM/AS对南非某省疑似为NTM的200例临床样本进行了鉴定，检出133例NTM，检出率较高的分别是胞内分枝杆菌(45.9%)、鸟分枝杆菌(11.3%)、戈登分枝杆菌(6.0%)、堪萨斯分枝杆菌(4.5%)。另有印度文献报道[11]以PNB含药培养基对MTB与NTM鉴别结果为参照，GenoType Mycobacterium CM/AS敏感度、特异度、分别为99.37%、98.33%。国内文献[12]报道采用HAIN公司线性探针杂交法鉴定NTM并与16S rRNA基因测序法比较，符合率100%，特异度100%。Rindi等[13]采用Hain公司的线性探针法鉴定了意大利某地区2004-2014年期间的147例NTM患者的培养物，发现NTM分离率以60岁以上的老年人(57.8%)为主，样本分离率以呼吸道最常见(76.2%)，其次为淋巴结(10.9%)和血液(2.7%)。尽管HAIN鉴定NTM成本较高，但其快速、准确、操作简便等优点值得其在临床广泛使用。

2.6 免疫学鉴定方法 分枝杆菌在生长过程中会分泌200余种蛋白，MPB64(Mycobacterial protein from BCG of Rm0.64 in electrophoresis)是在结核分枝杆菌的培养中分泌到菌体外的蛋白质，也是分泌时间早、分泌量最多的蛋白，而非结核分枝杆菌则不分泌该蛋白，因此，通过检测和鉴定MPB64可以鉴别MTB和NTM[14]。MPB64的检测需要首先在液体培养基或者固体培养基上培养出分枝杆菌，培养后的菌液采用MPB64抗原检测试剂盒(胶体金法)进行检测，若质控线(C)和检测线(T)均出现紫红色条带，则为MPB64阳性，为MTB，若仅质控线(C)出现紫红色条带，而检测线(T)未出现，则为NTM。MPB64抗原胶体金法检测需做好相关质控，阳性质控品采用BCG、牛分枝杆菌(ATCC93006)、结核分枝杆菌(ATCC93009)，阴性质控采用鸟分枝杆菌(ATCC95001)、堪萨斯分枝杆菌(ATCC95013)。潘爱珍等[15]以PCR扩增测序法为“金标准”，对MPB64免疫胶体金法和传统PNB/TCH法对分枝杆菌菌种鉴定能力进行了比较，结果显示胶体金法与PCR测序法结果一致率分别是95.93%、87.08%，胶体金法和PNB/TCH法鉴定结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为88.41%、99.64%和62.32%、99.29%，胶体金法检测所需时间为15min，优于PNB/TCH法的28天，因此，MPB64胶体金法对分枝杆菌的鉴定具有快速、省时、操作方便的特点，值得在临床推广。

3 NTM药敏试验

大多数NTM对常用的抗分枝杆菌药物具有耐药性[16-18]，目前采用的分枝杆菌药敏试验，包括BACTEC MGIT960和罗氏培养基绝对浓度法或比例法药敏试验所测药物已不能满足NTM病治疗的需要。目前引起NTM病的菌种主要是Ⅰ群的堪萨斯分枝杆菌、Ⅱ群的鸟-胞内分枝杆菌复合群(m.avium complex,MAC)、Ⅳ群的龟、脓肿分枝杆菌和偶然分枝杆菌，其中堪萨斯、MAC属于缓慢生长分枝杆菌，龟、脓肿、偶然分枝杆菌属于快速生长分枝杆菌。中华医学会结核病学分会对于以上几种常见的NTM病的药敏试验给出了指导性意见[16]，包括未经治疗的MAC病患者，仅推荐进行克拉霉素敏感性试验；对未经治疗的堪萨斯分枝杆菌病患者，仅需进行利福平药敏试验；对于快速生长分枝杆菌中的偶然、脓肿和龟分枝杆菌，常规药敏试验应包括阿米卡星、伊米配能(仅限于偶然分枝杆菌)、多西环素、氟喹喏酮类药物、磺胺类药物或复方磺胺甲嗯唑、头孢西丁、克拉霉素、利奈唑胺和妥布霉素等。目前对很多NTM菌种感染后引起的疾病知之甚少，部分NTM菌种的药敏试验需求较少，因此，针对NTM的药敏试验尚没有通用指南，下面结合文献报道对几种临床常见的NTM菌种感染所需的药敏试验进行综述。

3.1 鸟-胞内分枝杆菌(MAC)药敏试验 由于MAC对目前常用的几种抗结核药不敏感或耐药，对异烟肼和吡嗪酰胺天然耐药，而对大环内酯类药物敏感，美国FDA批准将阿奇霉素和克拉霉素用于MAC病的治疗，但需要连用其他1～2种抗生素(乙胺丁醇和利福平)。美国第九版《临床微生物手册》推荐使用微量肉汤稀释法进行MAC对克拉霉素的药敏试验，使用改良罗氏培养基上的培养产物进行，具体操作步骤参见文献报道[1]。克拉霉素药敏试验浓度(μg/mL)使用2～64，当≤4为敏感，8～16为中介，≥32为耐药，鸟分枝杆菌作为质控菌株，浓度(μg/mL)使用0.5、1和2。关于阿奇霉素的药敏试验，CLSI(临床和实验室标准化协会)推荐使用BACTEC 12B培养基的大量肉汤稀释法，浓度(μg/mL)使用16～512或32,128和512，当≤128为敏感，256为中介，≥512为耐药，鸟分枝杆菌作为质控菌株，浓度(μg/mL)使用8、16和32。CLSI建议仅做克拉霉素或阿奇霉素中的一种药敏试验即可，互相可预测另一种药物的敏感性。文献[17]显示鸟-胞内分枝杆菌复合群对克拉霉素的耐药率为11.36%，利福平耐药率为95.45%，利福喷汀耐药率29.55%，阿米卡星耐药率43.18%，

3.2 堪萨斯分枝杆菌药敏试验 中华医学会结核病学分会专家共识(简称“专家共识”)推荐，对未经治疗的堪萨斯分枝杆菌病患者，仅需进行利福平药敏试验，若利福平耐药，即要使用微量肉汤稀释法进行多种抗结核药物敏感试验[16]。目前推荐如下八种药物进行药敏试验：利福布汀、乙胺丁醇、异烟肼、链霉素、克拉霉素、阿米卡星、环丙沙星、甲氧嘧啶-新诺明或新诺明[13]，堪萨斯分枝杆菌(ATCC12478)或海分枝杆菌(ATCC927)用于堪萨斯分枝杆菌对利福平药敏试验的质控菌株。

3.3 海分枝杆菌药敏试验 目前海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)病的治疗常使用利福平、利福布汀、乙胺丁醇、克拉霉素、磺胺类药物、多西环素、米诺环素等单一药物治疗或1～2种药物联用。由于海分枝杆菌对上述药物的MIC范围较窄，因此“专家共识”推荐海分枝杆菌分离株不需进行常规药敏试验，但治疗失败患者例外[16]。Peter等[19]采用肉汤微量稀释法药敏试验研究了利福平、阿米卡星、克拉霉素、莫西沙星、链霉素五种药物间不同药物组合对海分枝杆菌的杀菌效果，发现利福平和阿米卡星药物组合杀菌效果最好，链霉素和克拉霉素药物组合最差。该文献还推荐使用海分枝杆菌作为耐多药结核病的研究模型，用于药敏试验研究。

3.4 快速生长分枝杆菌药敏试验 临床上快速生长分枝杆菌感染所致疾病中主要以龟、脓肿、偶然分枝杆菌为常见，“专家共识”推荐常规药敏试验应包括阿米卡星、伊米配能、多西环素、氟喹诺酮类药物、磺胺类、头孢西丁、克拉霉素、利奈唑胺和妥布霉素。采用微量肉汤稀释法进行常用几种药物的敏感试验，结果以MIC值报告，药物浓度及具体步骤参见文献报道[1],对于结果的报告，由于亚胺培南不稳定，龟和脓肿分枝杆菌需要长时间孵育，因此这2个菌种的药敏不报告亚胺培南结果，CLSI推荐妥布霉素仅用来做龟分枝杆菌药敏试验。对于其他快速生长分枝杆菌的药敏试验可参照龟、脓肿、偶然分枝杆菌的方法，若患者在规范治疗半年后，分枝杆菌培养仍为阳性则考虑需重新进行NTM的药敏试验。目前关于快速生长分枝杆菌药敏试验的质量控制，推荐使用外来分枝杆菌(M.peregrinum)(ATCC700686)作为质控菌株或金黄色葡萄球菌(ATCC29213)作为替代。文献[17]报道快速生长分枝杆菌群对阿米卡星和克拉霉素的耐药率分别为62.07%和12.07%，其中龟分枝杆菌对阿米卡星和克拉霉素耐药率分别为57.41%和9.26%，脓肿分枝杆菌对阿米卡星和克拉霉素耐药率分别为70.00%和10.00%。

综上所述，近些年来耐多药结核病以及HIV感染者合并结核病患者数量有增加的趋势，这也导致结核病人的免疫力下降，更易于感染NTM。结核病与NTM病临床特征相似，但治疗差异甚大，实验室快速、准确地诊断出MTB和NTM对于临床治疗结核病与非结核分枝杆菌病至关重要。因此推荐有条件的实验室对NTM进行分型检测，这对制定合理的治疗方案非常关键。NTM主要损害肺部，多数NTM对抗结核药物耐药，缓慢生长型和快速生长型NTM临床治疗用药存在差异，尽管还没有标准的药敏试验方法，但NTM治疗前仍有必要进行药敏试验，依据药敏试验结果及时调整用药方案。总之，对NIM进行快速、准确的分型诊断和有效的药敏试验，不论是对治疗非结核分枝杆菌病或是控制结核病疫情都是十分迫切的。

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天津市卫生局科技基金项目资助(2014KZ035)

1.天津市海河医院 检验科，300350;2.天津市呼吸疾病研究所，300350

郭明日(1982-)，男，主管检验师，研究生。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.02.054

R 516

A

1008-7044(2017)02-0246-04

2016-04-04)