去泛素化酶Rpn11在套细胞淋巴瘤中的表达及其临床病理意义

雷坚　刘小柳　张芸　曾亮　刘志红

摘要：目的：探讨去泛素化酶Rpn11蛋白在套细胞淋巴瘤（MCL）中的表达及其临床病理意义。方法：收集20例初治MCL的标本及资料，以10例反应性增生淋巴组织标本为对照，免疫组化检测组织中Rpn11蛋白的定位及表达，分析Rpn11表达与患者的临床病理指标的关系。结果：Rpn11蛋白定位于细胞核和细胞浆。MCL病理组织中Rpn11蛋白表达阳性率85%，高于對照组织40%（P=0.03）。套细胞淋巴瘤组织中Rpn11蛋白表达的阳性率与患者的Ann Arbor分期、血清白蛋白水平、Ki-67指数均相关（P<0.05），与呈阴性表达的MCL比较，Rpn11阳性者分期更晚、白蛋白水平更低、Ki-67指数更高。而Rpn11表达与患者的MIPI分组、B症状、骨髓浸润、pz一微球蛋白无关（P>0.05）。结论：Rpn11蛋白在MCL病理组织中的表达较对照组织为高，Rpn11可能是MCL预后较差的指标。

关键词：套细胞淋巴瘤；Rpn11；去泛素化；免疫组化

中图分类号：R733.4 文献标志码：A 文章编号：1008-2409（2016）05-0001-05

套细胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma，MCL）属于非霍奇金淋巴瘤中成熟B细胞肿瘤的一种，以t（11；14）（q13；q32）和Cyclin D1过度表达为其分子遗传学特征，2008年WHO将MCL定为“高度侵袭性”，80%～90%患者确诊时为Ann ArborⅢ、Ⅳ期，中位生存时间3～5年。作为一种侵袭性高、早期发现困难的淋巴瘤，MCL发生的病理机制及疾病进展的分子基础仍不明确。泛素-蛋白酶体途径是真核生物细胞内蛋白选择性降解的重要途径。泛素-蛋白酶体系通过参与癌性转化、肿瘤进展、免疫逃逸及肿瘤耐药等诸多代谢过程，影响肿瘤的发生发展。临床研究表明MCL是所有非霍奇金淋巴瘤中对蛋白酶体抑制剂最敏感的-类淋巴瘤，提示泛素-蛋白酶体系统在套细胞淋巴瘤的发生发展中存在功能紊乱。泛素-蛋白酶体系统中去泛素化酶可以避免错误修饰的蛋白进入泛素化降解途径。去泛素化酶Rpn11（Regulatory particle non-ATPase 11）是蛋白酶体19s调节亚基盖子的组成部分，Rpn11亚基作为蛋白酶体中最保守的非ATP酶，其在蛋白酶体去泛素化过程中发挥多效性作用，但目前国内外尚未见关于Rpn11在MCL中作用的研究报道。本研究采用免疫组化方法检测Rpn11在MCL组织中的表达情况，探讨其与MCL临床预后指标的关系，为MCL的临床治疗及预后评估提供相关依据。

1资料与方法

1.1一般资料

本研究收集2013年1月至2015年12月经中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院病理科确诊的初治MCL标本共20例作为研究对象。所有病例均经组织病理学及免疫组织化学、骨髓或外周血免疫表型确诊，分期依据Ann Arbor标准，危险度分层按照套细胞淋巴瘤国际预后指数（MIPI）标准进行。收集患者临床资料，包括性别、年龄、MIP1分组、Ann Arbor分期、是否骨髓浸润、B症状、β₂-微球蛋白、血清白蛋白、Ki-67指数。另选10例反应性增生的淋巴结组织标本作为对照。

1.2方法

1.2.1诎剂 Rpn11〔Anti-PSMD14 antibody（EPR4257）abl09123〕兔单克隆抗体购自abcam公司。DAB染色液试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

1.2.2免疫组化 所有标本均经10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，2.5μm厚度连续切片。4μm厚的连续切片用于免疫组化检测，切片经过烤片，二甲苯脱蜡，经柠檬酸抗原修复液进行微波修复20 min，3%H₂O₂孵育10 min，非免疫血清孵育10 min，滴加Rpn11兔单克隆抗体（1：500稀释），4℃冰箱孵育过夜。然后按照福州迈新生物技术公司DAB染色液试剂盒操作说明书染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

1.2.3结果判定 免疫组化结果参考Friedrichs标准进行评分：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6%～20%为1分，21%～50%为2分，≥51%为3分；染色程度与染色细胞百分率得分乘积为最后得分，>1分判为阳性表达；≤1分判为阴性表达。

1.3统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件对资料进行统计分析，率的比较采用Fisher确切概率法。选择双向检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 MCL临床病理资料分析

MCL患者20例，男16例，女4例；中位年龄59.5（44～77）岁；Ann Arbor分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期4例，Ⅲ期9例，Ⅳ期6例。MIPI危险度分组：低危10例（50%），中危7例（35%），高危3例（15%）。骨髓侵犯6例，脾脏受累2例，肠道受累5例。其中9例患者存在B症状。免疫表型显示：MCL细胞均表达CD20和CD5，T细胞抗原CD3阴性，均表达bcl-2与Cvclin D1，CD10、bcl-6阴性或弱阳性。

2.2 Rpn11蛋白在MCL及反应性增生淋巴结中的表达

HE染色可见肿瘤细胞呈小到中等体积的淋巴样细胞，胞核不规则，变异性染色质密集，核仁不明显。Rpn11定位于细胞核和细胞浆，呈棕黄色。实验结果显示MCL组织中Rpn11阳性表达率为85%（17/20），反应性增生的淋巴结组织中阳性表达率为40%（4/10），两者相比差异有统计学意义（P=0.03）。详见图1。

2.3 MCL患者Rpn11蛋白表达水平与临床病理特征的相关性分析

套细胞淋巴瘤组织中Rpn11蛋白表达的阳性率与患者的Ann Arbor分期、血清白蛋白水平、Ki-67指数均相关（P<0.05）；与呈阴性表达的MCL患者比较，Rpn11阳性患者的分期更晚、白蛋白水平更低、Ki-67指数更高。而Rpn11表达与患者的MIPl分组、B症状、骨髓浸润、β₂-微球蛋白水平无关（P>0.05）。详见表1。

3讨论

近年来，随着淋巴瘤分子标志物研究的深入，如Ki-67、TP53、SOX11、IGHV等许多与MCL预后密切相关的分子标志物被发现，另外，一些有关信号通路、表观遗传学等的分子标记物正在研究中。本研究通过免疫组化技术，发现去泛素酶Rpn11在套细胞淋巴瘤组织中表达增强，提示泛素一蛋白酶体系统异常参与套细胞淋巴瘤的发生发展。分析Rpn11表达与MCL临床相关指标的关系发现，Rpn11阳性患者的分期更晚、白蛋白水平更低、Ki-67更高，提示Rpn11可能是MCL的一项预后差的指标。

泛素-蛋白酶体系统存在于所有真生物的细胞内，通过蛋白酶体降解泛素标记的蛋白，是蛋白质选择性降解的主要方式。去泛素化通过影响细胞周期、调节细胞增殖及分化、调节细胞凋亡等参与肿瘤的发生和进展。哺乳动物细胞中，3种去泛素化酶与26 s蛋白酶体相关：USP14、UCHL5和Rpn11。研究发现，USP14和UCHL5的小分子靶向抑制物b-AP15可以诱导骨髓瘤细胞凋亡，并且可以逆转硼替佐米的耐药，此外，b-AP15抗MM骨髓瘤活性还与下调Cyclin B1、导致肿瘤细胞周期停滞相关。最近研究发现，b-AP15可以诱导华氏巨球蛋白血症（B细胞非霍奇金淋巴瘤中的一种）肿瘤细胞的凋亡。另有研究发现Rpn13在骨髓瘤细胞中高表达，并且临床前数据证实靶向Rpn13抑制剂可以逆转蛋白酶体抑制剂bortezomib耐药、改善骨髓瘤患者预后。以上研究结果提示，作为以Cyclin D1过表达为特征的小B细胞非霍奇金淋巴瘤，套细胞淋巴瘤的发生可能与去泛素化酶功能失常相关。笔者研究发现Rpn11在MCL组织中阳性率较反应性增生淋巴结组织高，提示除了蛋白酶体抑制剂，去泛素化酶也有可能成为MCL治疗的潜在靶点，这为去泛素化酶抑制剂用于治疗MCL提供了理论上的可行性。