盐酸普鲁卡因对人白血病HL—60细胞ID4基因甲基化状态的影响

林文远　朱春江　刘冯　陈蓓莉　农庆伟　吴贤义

摘要：目的：探讨盐酸普鲁卡因对体外培养的人白血病HL-60细胞ID4基因甲基化状态的影响。方法：体外培养HL-60细胞，使用不同浓度（2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L）的普鲁卡因处理细胞，分别采用MS-HRM、RT-PCR法检测HL-60细胞ID4基因启动子区域的甲基化状态和ID4mRNA的表达。结果：HL-60细胞ID4基因在普鲁卡因作用下呈现明显的去甲基化状态，ID4mRNA表达明显增加，且以上改变均随药物浓度的增加而增强（P<0.05）。结论：盐酸普鲁卡因对HL-60细胞的ID4基因启动子区域有去甲基化作用，上调细胞ID4 mRNA的表达。

关键词：盐酸普鲁卡因；ID4基因；甲基化；HL-60细胞

中图分类号：R733.7 文献标志码：A 文章编号：1008-2409（2016）05-0012-05

白血病是一类造血干细胞来源的恶性克隆性血液系统疾病，其发病机制尚不十分明确。研究认为DNA异常甲基化是血液系统恶性疾病发生、发展的重要机制之一，尤以抑癌基因的高甲基化最为重要。DNA结合抑制因子4（inhibitor of DNA binding，ID4）是一种新型的抑癌基因，其启动子区域异常甲基化可致使该基因的表达沉默，并失去其抑癌作用，从而导致白血病的发生。盐酸普鲁卡因作为一种非核苷类去甲基化药物，能够使已发生甲基化的CPG岛去甲基化，从而使沉默的抑癌基因重新表达，抑制肿瘤细胞增殖，促使其凋亡，进而达到治疗肿瘤的目的。本研究主要是体外观察盐酸普鲁卡因在不同浓度时人类白血病HL-60细胞ID4基因的甲基化状态及ID4 mRNA表达的变化，探讨普鲁卡因对HL-60细胞ID4基因甲基化状态的影响，为急性白血病的去甲基化治疗提供新的思路。

1材料与方法

1.1主要材料及来源

人类白血病HL-60细胞株购自中国科学院上海细胞库；IMDM培养基为Gibco公司；CCK8试剂盒购自日本同仁化学社；倒置荧光显微镜为Nikon公司；全波长酶标仪为美国MD Company；引物由杭州赫贝生物技术有限公司合成；EpiTect Bisulfite kit（48）Cat.no-59104购自QiaGen公司；MS-HRM检测试剂SsoFast Eva Green Supermix购自Bio-Rad公司；定量PCR仪为CFX connect Real-Time PCRSystem，配套使用的分析软件为BIO-RAD CFXManager（用于qPCR分析）及Precision Melt Analysis（用于HRM分析）；动物总RNA快速提取试剂盒购自Generay公司；逆转录试剂盒购自Fermentas公司；qPCR试剂SuperReal Premix Plus（with SYBR Green I）购自TIANGEN公司；PVDF膜为Millipore公司；ECL Plus发光试剂盒购自碧云天公司；ID4 antibody购于Santa Cruz公司；GAPDH antibody购于Bioworld公司。

1.2细胞培养与用药分组

HL-60细胞株置于IMDM培养基（含20%胎牛血清），在37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中进行传代培养。使用普鲁卡因2，4，6mmol/L处理细胞，并设0mmol/L为空白对照组。

1.3甲基化敏感性高分辨率溶解曲线分析法（MS-HRM）

分别提取普鲁卡因处理前及处理48 h后各组细胞DNA，Merinton SMA4000检测DNA浓度，按EpiTect Bisulfite kit（Cat.no-59104）说明书进行DNA的亚硫酸盐修饰及纯化，以纯化后的DNA为模板进行PCR扩增反应，上游引物：5′GATYATATTTTGGATTTGTAGTTGG3′，下游引物：5′CpG 196R：AAAAAACTATCATFCCTAACCC3′，PCR反应体系：SsoFast Eva Green Supermix 10μl、上下游引物各1μl（10μmol）、双蒸水6μl、DNA模板1μl。反应条件：95.0℃预变性5 min，95.0℃10 s、59.0℃15 s、72.0℃20 s，进行40个循环，72.0℃延伸10 min。使用Precision Melt Analysis分析軟件检测各组ID4甲基化程度。

1.4 RT-PCR法检测ID4 mRNA表达

Trizol一步法分别提取普鲁卡因处理前和处理48 h后各组细胞RNA，分光光度计检测其浓度及纯度，将RNA逆转录形成cDNA后进行PCR扩增，用GAPDH进行校正。ID4上游引物：5′CTGTGCCTGCAGTGCGATA3′，下游引物：5′CAGGTCCAGGATGTAGTCGATAA3′，目的产物大小为129 bp；GAPDH上游引物：5′AGAAGGCTGGGGCTCATITG3′，下游引物：5′AGGGGCCATCCACAGTCTTC3′，目的产物大小为258 bp。反应体系：SuperReal Premix Plus10μl、上下游引物各1μl（10 μmol）、cDNA模板8μl。反应条件：95.0℃预变性15 min，95.0℃10 s，60.0℃15 s，72.0℃20 s，45个循环，最后72.0℃延伸10 min。使用荧光定量PCR分析软件BIO-RAD CFX Manager进行统计和计算。

1.5统计学方法

使用SPSS 13.0软件分析处理数据，计量资料以x±s表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1普鲁卡因对HL-60细胞ID4基因甲基化状态的影响

用100%和0%的甲基化标准品做MS-HRM分析，所检测ID4样本的曲线越靠近100%说明甲基化程度越高，相反越靠近0%说明甲基化程度越低。在普鲁卡因处理前，HL-60细胞ID4基因处于完全甲基化状态。在经普鲁卡因处理后，细胞ID4基因呈现去甲基化状态，去甲基化程度随着药物浓度不断增大而增加，图1中2 mmol/L组多在1区范围，4 mmol/L及6 mmol/L组多在2区及3区范围，去甲基化程度均明显强于前者。详见图1。

2.2普鲁卡因对HL-60细胞ID4基因mRNA及蛋白表达的影响

HL-60细胞经普鲁卡因处理48 h后，细胞ID4基因mRNA及蛋白的表达量均较对照组明显增加，且两者的表达量均随药物浓度的增大而不断增加，各浓度组之间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。详见表1。

3讨论

DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，指在DNA甲基转移酶的作用下，以s腺苷甲硫氨酸为供体将甲基转移到胞嘧啶第5位碳原子上的过程。它在基因表达、基因组印记、X染色体灭活及维持染色体完整性等多种生物学过程中发挥着重要作用。研究表明，DNA的异常甲基化可导致癌基因的激活和抑癌基因的沉默，与多种肿瘤的发生、发展密切相关。近年来，DNA甲基化尤其抑癌基因启动子区域的高甲基化的研究在白血病的发生发展、诊断、病情预测和指导治疗等方面都具有重要意义。

人类ID4基因位于6p21.3-p22号染色体上，其编码的ID4蛋白属于螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）转录因子的成员，因其缺乏富含碱性氨基酸的DNA结合域，本身并不能与DNA结合，但它可以通过与碱性HLH（bHLH）蛋白形成异二聚体而抑制其与DNA的结合，是bHLH转录因子的负性调节物。bHLH的高表达可促进干细胞向终末细胞分化，低表达则抑制干细胞分化使其处于持续增殖状态。ID4基因广泛表达于人体正常组织细胞中，并参与细胞增殖、分化的调控。ID4在不同来源、不同性质的肿瘤组织中表达程度不同，既可作为癌基因，又可作为抑癌基因，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。研究发现，在神经系统肿瘤及卵巢癌中的ID4基因呈现高表达，其能够抑制细胞分化、促进细胞增殖，对肿瘤的形成起促进作用；而在大部分血液系统肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等肿瘤中，ID4基因却表现为抑癌作用。在人类急性白血病细胞中普遍存在ID4基因启动子区域的甲基化，检测ID4基因的甲基化状态有助于评估急性白血病预后及复发。于力等研究发现，在小鼠白血病模型中，ID4基因启动子区域的DNA呈现出高甲基化的状态并导致基因表达沉默，而在正常小鼠的骨髓细胞中该基因处于非甲基化状态。应用逆转录病毒将ID4基因的蛋白编码序列转入小鼠白血病T细胞恶性肿瘤细胞系YAC-1后，在体外细胞培养及在免疫缺陷鼠皮下接种，均发现白血病细胞ID4基因表达增加，并出现了肿瘤细胞生长受抑和凋亡增加，因此，首次提出了ID4是一种新型的抑癌基因。

由于DNA甲基化并未改变DNA序列及遗传密码，因此，该过程具有可逆性。目前，对于去甲基化药物的研究主要集中在两个方面：一类是核苷类似物，如5-氮-2-脱氧胞苷等，能参与快速增长的肿瘤细胞的DNA合成，通过占有、消耗DNA甲基转移酶（DNMTs）特异性地抑制DNA甲基化。另一类是非核苷类似物，如普鲁卡因。普鲁卡因是一种非共价结合的非核苷类DNMTs抑制剂，其可通过与DNA的CPG岛高特异地结合，直接干扰DNMTs与DNA的结合位点，使超甲基化的CPG岛去甲基化，从而使沉默的抑癌基因重新表达，发挥抗肿瘤的作用，同时避免了核苷类DNMTs抑制剂与酶共价结合带来的骨髓抑制等毒性反應。普鲁卡因能使人鼻咽癌CNE-2Z细胞的抑癌基因RASSF1A去甲基化，促其mRNA的表达增加，抑制了CNE-2Z细胞的增殖。盐酸普鲁卡因能够逆转人肝癌HepG2细胞Syk基因启动子区域CPG岛的甲基化，恢复Syk基因的活性并上调Syk蛋白的表达，抑制了肝癌细胞的增殖。

本实验结果显示，未经盐酸普鲁卡因处理的HL-60细胞ID4基因处于高甲基化状态，ID4mRNA及ID4蛋白的表达均处于低水平状态，经药物处理48 h后细胞ID4基因出现明显的去甲基化状态，ID4 mRNA及ID4蛋白表达均明显增加，随着药物浓度的增加，去甲基化的程度和ID4蛋白的表达在不断增加。上述结果表明HL-60细胞ID4基因的表达受基因启动子区域甲基化的调控，盐酸普鲁卡因能够使ID4基因启动子区域发生去甲基化，从而恢复基因的活性，上调ID4蛋白的表达，达到抑制肿瘤细胞的作用，并且这种效应可随药物浓度的增加而增强。

急性白血病及淋巴瘤的ID4基因启动子区域的异常甲基化可使该基因表达沉默，失去其抑癌作用而导致血液肿瘤的发生与进展。本研究中，盐酸普鲁卡因能够逆转白血病HL-60细胞ID4基因启动子区域的高甲基化状态，从而恢复ID4基因的表达，并对HL-60细胞的生长起到抑制作用。对于非核苷类药物盐酸普鲁卡因的去甲基化作用，如何更好地发挥其抗肿瘤效应需进一步的探索。