基于ROCK-MAPK通路观察糖心宁干预糖尿病心肌病作用机制研究*

岳改英李 景解欣然周旭升李江敏子谷玉红易京红

（1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.北京市房山区韩村河镇社区卫生服务中心，北京 102423；3.北京市中医研究所，北京 100010）

·研究报告·

基于ROCK-MAPK通路观察糖心宁干预糖尿病心肌病作用机制研究*

岳改英1，2李 景1△解欣然3周旭升1李江敏子1谷玉红1易京红1△

（1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.北京市房山区韩村河镇社区卫生服务中心，北京 102423；3.北京市中医研究所，北京 100010）

目的 观察糖心宁对糖尿病心肌病大鼠心肌组织ROCK、JNK及P38MAPK蛋白表达的影响，探讨其对ROCK-MAPK信号通路的作用机制。方法 采用链脲佐菌素制备糖尿病心肌病大鼠模型，40只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、法舒地尔组、糖心宁高剂量组、糖心宁等效剂量组各8只。空白组及模型组灌服等量清洁饮用水，法舒地尔组给予法舒地尔腹腔注射，糖心宁组灌服中药糖心宁。给药8周后处死大鼠，计算左心室肥厚指数，检测血糖、血脂水平；HE染色观察心肌细胞形态学变化；免疫组化法检测心肌组织ROCK、JNK、P38MAPK蛋白表达情况。结果 给药8周末，模型组大鼠空腹血糖、甘油三酯明显高于空白组（均P＜0.05）；与模型组比较，法舒地尔组、糖心宁高剂量组、糖心宁等效剂量组甘油三酯水平明显降低（均P＜0.05），但空腹血糖未见明显变化（均P＞0.05）。模型组大鼠心肌肥厚指数明显高于空白组（P＜0.05）；与模型组比较，法舒地尔组、糖心宁高剂量组、糖心宁等效剂量组心肌肥厚指数均低于模型组（P＜0.05）。HE染色光镜下观察，空白组大鼠心肌细胞肌节完整，肌丝、线粒体排列比较整齐。模型组大鼠心肌细胞肿胀，肌丝排列稀疏，肌丝断裂、溶解，心肌出现大面积玻璃样变性及坏死。糖心宁高剂量组、糖心宁等效剂量组、法舒地尔组大鼠心肌细胞肿胀，肌丝排列均较模型组有明显好转。与空白组大鼠比较，模型组大鼠的ROCK1蛋白表达显著增加（P＜0.05），而ROCK2蛋白表达未见明显增加（P＞0.05）。与模型组大鼠比较，法舒地尔组、糖心宁高剂量组、糖心宁等效剂量组的ROCK1蛋白表达受到显著抑制 （P＜0.05），ROCK2蛋白表达未见明显改变 （P＞0.05）。与法舒地尔组比较，糖心宁高剂量组明显抑制ROCK1蛋白表达（P＜0.05），而糖心宁等效剂量组则并不明显（P＞0.05）。与空白组大鼠比较，模型组大鼠的JNK、P38MAPK蛋白表达均显著增加（P＜0.05），与模型组大鼠比较，法舒地尔组、糖心宁高、等效剂量组大鼠JNK、P38MAPK蛋白表达均明显受到抑制（P＜0.05）。结论 糖心宁能减轻糖尿病心肌病大鼠的心室重构，其机制可能与抑制ROCK-MAPK信号通路有关。

糖尿病心肌病 心室重构 糖心宁 ROCK-MAPK信号通路

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病状态下排除其他引起心脏异常的因素后，出现的一系列心脏结构异常，并最终导致心肌重构的病理改变［1］，是一种独特的心肌病理状态，心肌肥大、心肌灶性坏死、广泛纤维化和心肌内小动脉内膜及内膜下增厚是糖尿病心肌病的特征性病理表现［2］，现代医学认为多个信号传导通路参与了心室重构过程，目前认识到的介导心室重构的信号通路主要包括蛋白激酶 C（PKC）通路、钙调神经磷酸酶（CaN）通路和丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）通路等。本实验通过给予ROCK通路阻滞剂法舒地尔作为对照药，探讨糖心宁对ROCK-MAPK信号通路的影响及其减轻心室重构的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠44只，SPF级，体质量180～220 g，于SPF级动物房喂养，饲养条件为恒温20～24℃，相对湿度40～70℃，明暗交替12 h/12 h，普通饲料，自由进食水。由中国食品药品检定研究院提供，动物合格证号：SCXK（京）2014-0013。

1.2 试药与仪器 糖心宁（太子参、麦冬、五味子、丹参、川芎、香附、香橼、佛手、牡丹皮、赤芍、黄连），由北京中医医院中药房提供。糖心宁制备成水煎剂，等效剂量为成人正常剂量按体表面积系数折算乘以7，高剂量为等效剂量的2倍。盐酸法舒地尔注射液（依立卢，旭化成制药株式会社，批准文号：H20100282）。链脲佐菌素（STZ，货号：S0130，Sigma生产）、兔抗大鼠MMP-2单克隆抗体（货号：BA0569，武汉博士德生物公司生产）、兔抗大鼠 MMP-9单克隆抗体（货号：PB0710，武汉博士德生物公司生产）、兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗体（货号：BA0575，武汉博士德生物公司生产）、兔抗大鼠TIMP-2多克隆抗体等（货号：BA0576，武汉博士德生物公司生产）、脱水机、包埋机 （Leica公司提供，EG1140C）、石蜡切片机（Leica公司提供，RM2135），生物图像分析软件AON-STUDIO 2012等。

1.3 造模与给药 采用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射制作糖尿病大鼠模型［3-4］。普通饲料适应性喂养1周后，禁食12 h，期间自由饮水，造模组35只大鼠按55 mg/kg剂量单次腹腔内注射STZ，空白组9只大鼠腹腔内注射等体积柠檬酸缓冲液，分别于72 h、1周后，采用葡萄糖氧化酶法尾静脉取血测定空腹血糖，两次空腹血糖均≥11.1 mmol/L，定义为糖尿病大鼠造模成功。第5周（STZ注射后第4周），空白组随机抽取1只大鼠、造模组随机抽取3只大鼠取材，HE染色，观察空白组及造模组的心肌组织，若造模组表现为心肌细胞肿胀，肌丝排列稀疏，肌丝断裂、溶解，心肌出现大面积玻璃样变性及坏死，可认为DCM大鼠造模成功。空白组大鼠8只，模型组大鼠32只，将模型组随机分为4组，分别为模型组、法舒地尔组、糖心宁高剂量组、糖心宁等效剂量组。空白组、模型组予等量清洁饮用水灌胃，每日1次，按1 mL/100 g计算，法舒地尔组给予法舒地尔10 mg/（kg·d）腹腔注射，糖心宁高剂量组给予糖心宁9 g/（kg·d）灌胃，等效剂量组给予4.5 g/（kg·d）灌胃，每日1次，共给药8周。

1.4 标本采集与检测 1）一般情况：平时记录大鼠活动状态、毛色、精神状态、饮食、二便情况。每周测血糖和称体质量。2）心肌肥厚指数（LVHI）：给药8周结束后，腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）将大鼠麻醉，腹主动脉取血，3000 r/min离心15 min，分离血清，处死动物，迅速取出心脏，称取动物全心质量（CW）、左心室游离壁湿质量（LVW），计算LVHI，LVHI=LVW/CW。心脏保存于10%甲醛溶液。3）心肌组织形态学观察：HE染色光镜下观察大鼠心肌细胞肿胀程度，肌丝、肌纤维排列情况。4）免疫组化法检测心肌组织ROCK、JNK、P38MAPK蛋白表达：采用免疫组化方法石蜡切片常规脱蜡至水，过梯度酒精，PBS清洗后甩干，内源性过氧化物酶封闭消除背景染色，PBS清洗，浸入柠檬酸盐溶液，水浴锅加热法修复抗原，冷却至常温，正常山羊血清封闭非特异性抗原，PBS清洗甩干，滴加一抗小鼠一抗，4℃过夜。PBS泡洗、甩干，加入羊抗小鼠二抗，PBS洗片，DAB显色，封片，在400倍镜下拍片，每张片选10个视野。应用生物图像分析软件 AON-STUDIO 2012对ROCK、JNK、P38MAPK（细胞质中棕褐色颗粒为阳性）表达进行图像分析，测量阳性物质的面积百分比（Percent）和积分光密度（IOD），结果用质量评分公式Q=P/I（Q：Quality，P：Percent阳性物质表达面积，I：IOD值）来评价蛋白表达情况。

1.5 统计学处理 应用Sigmastat 4.0软件。进行方差分析，各组间两两差异比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血糖、血脂水平比较 见表1。结果显示，模型组大鼠空腹血糖、甘油三酯明显高于空白组（均P＜0.05）；与模型组比较，法舒地尔组、糖心宁高剂量组、糖心宁等效剂量组甘油三酯水平明显降低（均P＜0.05），但空腹血糖未见明显变化（均P＞0.05）。

表1 各组大鼠血糖、血脂水平比较（）

表1 各组大鼠血糖、血脂水平比较（）

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组 别 n 血糖（mmol/L） 甘油三酯（mmol/L）空白组 8 5.68±0.53 1.73±0.69模型组 8 24.77±3.22*11.29±6.31*法舒地尔组 8 25.69±2.92 4.01±2.06△糖心宁高剂量组 8 26.18±5.03 5.38±3.29△糖心宁等效剂量组 8 25.20±4.76 2.18±1.43△

2.2 各组大鼠LVHI比较 见表2。模型组大鼠LVHI明显高于空白组（P＜0.05）；与模型组比较，法舒地尔组、糖心宁高剂量组、糖心宁等效剂量组心肌肥厚指数均低于模型组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠LVHI比较（）

表2 各组大鼠LVHI比较（）

组别 n CW（g）空白组 8 1.28±0.19模型组 8 1.77±0.18法舒地尔组 8 0.99±0.08糖心宁高剂量组 8 1.03±0.18糖心宁等效剂量组 8 1.08±0.19 LVW（g） LVHI 0.93±0.12 0.64±0.02 1.13±0.09 0.73±0.08*0.65±0.09 0.65±0.06△0.67±0.09 0.64±0.06△0.69±0.12 0.65±0.06△

2.3 各组大鼠心肌组织病理学变化比较 见图1。HE染色光镜下观察，空白组大鼠心肌细胞肌节完整，肌丝、线粒体排列比较整齐。模型组大鼠心肌细胞肿胀，肌丝排列稀疏，肌丝断裂、溶解，心肌出现大面积玻璃样变性及坏死。糖心宁高剂量组、糖心宁等效剂量组、法舒地尔组大鼠心肌细胞肿胀，肌丝排列均较模型组有明显好转。

图1 各组糖尿病心肌病大鼠心肌组织（HE染色，200倍）

2.4 各组大鼠心肌组织ROCK1、ROCK2蛋白表达比较 见表3。与空白组大鼠比较，模型组大鼠的ROCK1蛋白表达显著增加（P＜0.05），而ROCK2蛋白表达未见明显增加（P＞0.05）。与模型组大鼠比较，法舒地尔组、糖心宁高剂量组、糖心宁等效剂量组的ROCK1蛋白表达受到显著抑制 （P＜0.05），ROCK2蛋白表达未见明显改变（P＞0.05）。与法舒地尔组比较，糖心宁高剂量组明显抑制ROCK1蛋白表达（P＜0.05），而糖心宁等效剂量组则并不明显（P＞0.05）。

表3 各组大鼠ROCK1、ROCK2蛋白表达比较（）

表3 各组大鼠ROCK1、ROCK2蛋白表达比较（）

与法舒地尔组比较，#P＜0.05。

组别 n ROCK1 ROCK2空白组 8 146.17±10.54 50.99±10.79模型组 8 187.21±8.87*64.51±11.74法舒地尔组 8 89.14±11.00△61.61±6.78糖心宁高剂量组 8 96.62±14.28△#57.28±10.79糖心宁等效剂量组 8 102.13±8.54△56.97±7.01

2.5 各组大鼠心肌组织JNK、P38MAPK蛋白表达比较 见表4。与空白组大鼠比较，模型组大鼠的JNK、P38MAPK蛋白表达均显著增加（P＜0.05），与模型组大鼠比较，法舒地尔组、糖心宁高、等效剂量组大鼠JNK、P38MAPK蛋白表达均明显受到抑制（P＜0.05）。

表4 各组大鼠JNK、P38MAPK蛋白表达比较（）

表4 各组大鼠JNK、P38MAPK蛋白表达比较（）

组别 n JNK P38MAPK空白组 8 62.88±14.87 64.99±11.42模型组 8 157.19±22.25*117.82±12.70*法舒地尔组 8 129.36±17.10△45.56±7.99△糖心宁高剂量组 8 95.91±13.94△51.63±10.21△糖心宁等效剂量组 8 126.60±14.23△52.94±7.44△

3 讨 论

心室重构是心脏对损伤、负荷、神经体液激素等病理性刺激的代偿性、适应性变化，但是长期的病理性刺激会导致适应不良，产生心肌肥大、心肌细胞凋亡及间质纤维化等结构性改变，使心肌相对缺血、缺氧，进而发展成为心力衰竭，是糖尿病心肌病的特征性病理表现。

Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）信号通路是机体各组织中普遍存在的一条信号传导通路，ROCK与其下游效应分子是细胞内信号传导通路的重要成分。目前多种心室重构动物模型中均发现ROCK通路的活化，包括压力负荷、损伤、激素（AngⅡ、醛固酮及异丙肾上腺素等）及糖尿病诱导的大鼠模型［5-9］。ROCK主要包括两种亚型：ROCK1和ROCK2。ROCK1定位于第18号染色体，包含1354个氨基酸。ROCK2定位于第2号染色体，包含1388个氨基酸。两者具有65%的氨基酸同源性和92%的催化结构域同源性。有研究显示ROCK在糖尿病心肌病的心肌重构中发挥了作用，心脏局限的ROCK1高表达能促使心肌纤维化和细胞凋亡，加速心室重构成为心力衰竭［10-11］，而ROCK1基因剔除能抑制心肌纤维化和细胞凋亡，完全防止小鼠死亡，并阻止心室重构进展成为心力衰竭［10］。而ROCK2［12］能抑制心肌肌钙蛋白T/I，故ROCK2可能参与调解细胞的收缩功能。

MAPK是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞粘附等激活的有丝分裂原活化蛋白激酶，主要包括3个亚族：ERK、JNK、p38MAPK。Zhang L等［13］研究发现抑制P38MAPK磷酸化后可减少心肌纤维化，减轻心室重构。Li CJ等［14］研究表明通过抑制JNK和P38MAPK的激活后可减轻DCM大鼠的心室重构。MAPK作为ROCK的下游通道，通过抑制ROCK通路，进而使MAPK通路的JNK、P38MAPK等蛋白表达受到抑制，能够减轻DCM大鼠的心肌重构。Fierro C等［15］研究也发现，在左心室和主动脉壁中法舒地尔能降低MYPT-1、ERM及P38MAPK的磷酸化水平。本实验中法舒地尔组通过抑制ROCK进而抑制JNK、P38MAPK蛋白表达，进而减轻心室重构，与既往研究也是基本一致的。同时本实验研究显示DCM大鼠ROCK1蛋白表达显著增加，ROCK2蛋白表达未见明显变化，说明主要通过激活DCM大鼠的ROCK1进而激活了ROCK-MAPK通路参与了心室重构。

糖心宁是我院国家级名老中医魏执真教授多年临床实践形成的经验方剂。方以太子参、麦冬、五味子益气养心，以香附、香橼、佛手宽胸理气，配以丹参、川芎活血通脉，牡丹皮、赤芍凉血清热，黄连厚肠止泻，诸药相伍，共奏益气养心、理气通脉、凉血清热之功。既往实验研究结果［16］显示，糖心宁能够改善实验性DCM大鼠的心肌、微血管和冠状动脉病变；对DCM心肌超微结构变化病理改变具有明显改善作用，从而起到对心脏的保护作用，延缓心室重构。本实验中，与法舒地尔组比较，糖心宁高剂量组、等效剂量组也通过抑制ROCK进而抑制JNK、P38MAPK蛋白表达，说明糖心宁可能通过与法舒地尔相同的机制即抑制ROCKMAPK从而减轻DCM的心室重构。

综上所述，本实验研究通过给予ROCK通路阻滞剂法舒地尔作为对照药，研究糖心宁减轻糖尿病心肌病大鼠心室重构的信号转导通路，初步发现糖心宁高剂量组、等效剂量组抑制ROCK1、JNK、P38MAPK蛋白表达与法舒地尔组基本一致，其改善实验性糖尿病心脏病大鼠心肌病变，延缓心室重构可能是通过ROCKMAPK信号通路实现。实验设计针对ROCK-MAPK通路中MAPK3个亚族中的JNK、P38MAPK进行了研究，但对ERK这一支通路尚未涉及；研究中还发现ROCK2蛋白表达未见明显变化，其在DCM大鼠心室重构中的作用有待进一步探讨。

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Mechanism Research on the Effect of Tangxinning on Diabetic Cardiomyopathy Based on ROCK-MAPK Signal Pathway

YUE Gaiying，LI Jing，XIE Xinran，et al.
Affiliated Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine of Capital Medical University，Beijing 100010，China.

Objective：To observe the effect of Tangxinning on the expression of ROCK，JNK and P38MAPK protein in myocardium of diabetic rats with cardiomyopathy，and to explore its mechanism of ROCK-MAPK signal pathway.Methods：Diabetic cardiomyopathy rats were induced by streptozotocin.The rats were randomly divided into blank group，model group，fasudil group，Tangxinning high dose group and Tangxinning equivalent dose group with 8 cases in each group.The blank control group and the model group were given the same amount of clean drinking water.The fasudil group was given intraperitoneal injection of fasudil，the Tangxinning group was given Chinese medicine Tangxinning.After 8 weeks，the rats were sacrificed and the left ventricular hypertrophy index was calculated and the levels of blood glucose and lipid were measured.The morphological changes of myocardium were observed by HE staining.The expression of ROCK，JNK and P38MAPK protein in myocardium was detected by immunohistochemistry.Results：Compared with the model group，the left ventricular hypertrophy wassignificantly decreased in the fasudil group，the Tangxinning high-dose group and the Tangxinning equivalentdose group（P＜0.05）.The improvement on the swelling of the cardiomyocytes was significant（P＜0.05），and the expression of ROCK1，JNK and P38MAPK was decreased significantly，but no significant changes in ROCK2 protein expression.Conclusion：Tangxinning can reduce the ventricular remodeling in rats with diabetic cardiomyopathy，and its mechanism may be related to inhibition of ROCK-MAPK signaling pathway.

Diabetic cardiomyopathy；Ventricular remodeling；Tangxinning；ROCK-MAPK signal pathway

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0026-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.008

2016-10-13）

首都中医药研究专项一般项目（15ZY15）；首都医科大学附属北京中医医院“育苗计划”院级课题（2014YM-07）

△通信作者（电子邮箱：kycyjh@sina.com）