益气养阴祛瘀方对干燥综合征颌下腺细胞AQP5及M3R表达的影响*

秦 源林崇泽孙 晗李志宇王新昌

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；2.浙江省新华医院，浙江 杭州 310053）

·研究报告·

益气养阴祛瘀方对干燥综合征颌下腺细胞AQP5及M3R表达的影响*

秦 源1林崇泽1孙 晗1李志宇1王新昌2△

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；2.浙江省新华医院，浙江 杭州 310053）

目的 观察益气养阴祛瘀方含药血清对干燥综合征（SS）患者颌下腺细胞AQP5及M3R表达的影响。方法 制备不同剂量SD大鼠益气养阴祛瘀方含药血清，再分别给予以下处理：空白组（仅含RPMI1640培养液），空白血清组（10%空白血清+RPMI1640培养液），分别予含5%、10%、15%、20%不同浓度的含药血清+ RPMI1640培养液组，共6组。培养细胞24 h后，分别以倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜观察细胞，Western blot检测细胞中AQP5及M3R蛋白表达水平。结果 益气养阴祛瘀方含药血清作用后，激光共聚焦显微镜观察抗体标记细胞的荧光强度明显增强。Western blot检测AQP5与M3R的蛋白表达均有上调。含药血清组中的AQP5及M3R蛋白的表达明显高于空白血清组，且10%、15%含药血清组高于5%含药血清组（P＜0.05），但与20%相差不大（P＞0.05）。结论 益气养阴祛瘀方可以上调颌下腺细胞中AQP5及M3R蛋白的表达，而且与之成一定的剂量依赖关系。

干燥综合征 益气养阴祛瘀方 含药血清 水通道蛋白AQP5 M3R

干燥综合征（SS）是一种以淋巴细胞大量侵犯人体的外分泌腺，尤以唾液腺及泪腺为主，导致其分泌功能降低的自身免疫性疾病。患者主要表现为眼干、口干等症状，同时伴有内脏多系统损害，临床表现多种多样，目前该病的发病机制尚不十分明确。临床治疗多依赖于激素，治疗初期效果尚可，但是长期运用效用下降，最主要的是用药带来的副作用令人担忧。本课题组一直致力于益气养阴祛瘀方对SS治疗作用的研究，我们前期的工作表明，该方不仅能很好的整体调节了SS患者和自发性SS动物模型NOD小鼠的免疫功能，而且对SS患者口、眼干燥的临床症状和对NOD小鼠的唾液分泌量、颌下腺损伤指数以及局部免疫炎症微环境也有明显的改善作用［1-3］。本实验主要采用血清药理学方法，探讨益气养阴祛瘀方对患者颌下腺细胞中AQP5及M3R的表达作用，对于深入研究中药方剂对外分泌腺腺体分泌功能的作用机制，以及寻求SS治疗方法方面具有重要意义。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性SD大鼠共16只，SPF级，体质量190~200 g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002，饲养环境：温度（23±2）℃，相对湿度（55±10）%。

1.2 试药与仪器 益气养阴祛瘀方：生地黄24 g，玄参15 g，麦冬15 g，石斛12 g，白芍12 g，黄芪24 g，丹参30 g，益母草15 g。由浙江中医药大学附属新华医院药剂科制备浓缩煎剂。颌下腺细胞由大连中科院提供。RPMI1640培养液（美国Gibco公司），FBS胎牛血清（美国Gibco公司），青霉素-链霉素溶液（100X碧云天），PBS缓冲液（杭州诺森德生物技术有限公司），0.25%胰酶（含0.02%的EDTA），一抗兔抗人AQP5抗体（abcam公司），一抗兔抗人M3R抗体（美国Santa Cruz公司），二抗羊抗兔IgG抗体（美国Santa Cruz公司），二抗羊抗兔IgG抗体FITC（美国Santa Cruz公司），SDS-PAGE凝胶配置试剂盒（碧云天），RIPA快速裂解液、PMSF（碧云天），预染蛋白分子量标准（碧云天），戊巴比妥钠（浙江中医药大学动物实验中心提供）。二氧化碳培养箱（Thermo Fisher），离心机（Thermo Fisher），荧光倒置显微镜 （OLYMPUS），激光共聚焦显微镜（OLYMPUS），SW-CJ-2F型双人双面超净化工作台（苏州净化设备有限司），液氮罐（美国），SDS-PAGE电泳仪（美国BioRad）。

1.3 中药含药血清制备 SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组和益气养阴祛瘀方组，每组8只。正常组以同等量的生理盐水灌胃，中药组以益气养阴祛瘀方灌胃，连续7 d。每天观察小鼠的生长情况。动物给药量为益气养阴祛瘀方9.2 g/kg。在最后一次给药2 h后，10%戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主动脉取血（取血前禁食不禁水12 h），室温下静置2 h后4000 r/min离心10 min，分离血清至EP管中，56℃水浴灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤，分装后-20℃保存备用。

1.4 颌下腺细胞的培养和含药血清处理 HSG细胞常规培养于含10%胎牛血清和抗生素的RPMI1640培养液中。1~2 d更换培养液，以倒置相差显微镜观察细胞形态，覆盖瓶壁面积达70%~80%时，以0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，分瓶继续培养，每周传代1~2次。HSG细胞经常规接种后，24 h后待细胞贴壁并生长良好，换用含0.5%胎牛血清的RPMI1640完全培养基饥饿24 h使细胞同步化于静止期。分别给予以下处理：空白组（仅含RPMI1640培养液），空白血清组（含10%的空白血清+RPMI1640培养液），分别予5%、10%、15%、20%浓度含药血清+RPMI1640培养液培养细胞，共6组。以倒置显微镜观察细胞生长状况，培养24 h后收集细胞。

1.5 标本采集与检测 1）激光共聚焦观察细胞。收集细胞，以含1%BSA的PBS缓冲液清洗细胞，4%的多聚甲醛（PFA）固定细胞1 h后，用含1%BSA的PBS缓冲液清洗细胞3次，每次5 min，以去除多余的PFA溶液，一抗4℃孵育过夜，同样方法清洗细胞3次后，加入荧光二抗标记，室温下1 h。以PBS清洗后，将其置于激光共聚焦下观察。2）Western Blot法检测颌下腺细胞中AQP5及M3R蛋白含量表达。收集细胞，以PBS缓冲液清洗细胞3次，加入含PMSF的RIPA细胞快速裂解液，置于冰上裂解30 min，轻轻将裂解好的细胞用细胞刮刮至一边，并将其移入EP管中，4℃下10000 r/min离心10 min，收集上清液，以BCA法检测上清液中蛋白浓度；每管按4∶1比例加入5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5 min变性；10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜；5%脱脂奶粉室温封闭90 min，加入一抗AQP5、M3R抗体（均为1∶1000）孵育过夜，膜以TBST清洗3次，然后加入羊抗兔IgG（1∶10000）孵育2 h，再次洗膜后获取图像并做分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料均以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态学观察 见图1。HSG细胞边界外廓清楚，呈梭形、多边形、薄椭圆形，形态不一，胞质丰富，视野下有少量空泡颗粒，细胞之间相互融合，呈现“铺石路样”形态。进入对数生长期后，增殖速度加快，排列紧密。含药血清干预后细胞形态无明显改变，相对清晰，细胞量稍微减少，空泡颗粒减少，随着含药血清浓度的增加细胞表面在一定程度上有少量磨砂样改变。

图1 HSG细胞形态学观察（100倍）

2.2 激光共聚焦显微镜观察结果 见图2。含药血清干预细胞后，以激光共聚焦显微镜进行观察，细胞内AQP5、M3R荧光强度明显增强，10%含药血清组所标记的明显高于空白血清组。

图2 HSG细胞激光共聚焦显微镜观察结果（FITC免疫荧光染色，200倍）

2.3 HSG细胞AQP5及M3R蛋白表达 见表1，图3。用Western blot法测定益气养阴祛瘀药诱导下的HSG细胞AQP5及M3R蛋白表达情况。AQP5蛋白表达5%含药血清组高于空白组，10%含药血清组高于5%血清组，15%含药血清组高于空白组，并且高于5%、10%含药血清组（P＜0.05）；同样M3R蛋白表达趋势与AQP5一致，15%含药血清组分别高于10%、5%含药血清组和空白血清组（P＜0.05）。

表1 各组AQP5、M3R蛋白表达水平比较（分，）

表1 各组AQP5、M3R蛋白表达水平比较（分，）

与空白组比较，*P＜0.05；与空白血清组比较，△P＜0.05；与5%含药血清组比较，★P＜0.05。

组别 n AQP5 M3R空白组 0.805±0.049 1.519±0.099空白血清组 0.855±0.001 1.526±0.075 5%含药血清组 0.927±0.094*1.729±0.067*△10%含药血清组 1.104±0.149*△1.778±0.109*△15%含药血清组 1.165±0.056*△★1.898±0.094*△★20%含药血清组 1.144±0.154*△★1.887±0.082*△★

图3 AQP5、M3R蛋白表达

3 讨 论

本次实验采取血清药理学方法，以益气养阴祛瘀方为依托，干预SS患者颌下腺细胞，观察AQP5和M3R的表达情况。血清药理学方法是由日本学者田代真一最早提出的，经过数十年的验证和不断完善，目前已被广泛的运用。但是口服给药剂量的多少仍然是比较棘手的问题，因为含药血清在体外环境中，浓度已被稀释，反应体系浓度达不到在机体内条件下的药物浓度，在这种情况下，很可能会出现假阴性。另中药成分很复杂，配伍更是千变万化，除了有效成分外，还有很多杂质，如鞣质，电解质等，加上药物的酸碱度也有可能会对体外的细胞、器官或组织等产生一些的影响，制约着体外研究的进行［4］，这是此次实验中也应当考虑的问题，为此本研究设置了多组对照，期望尽量减少外来因素干扰实验。

水通道蛋白（AQP）是广泛存在于原核和真核细胞膜上转运水的特异孔道，是主体内在蛋白（MIP）家族的成员，到目前为止，发现的哺乳动物AQP家族已有13个成员（AQP0～AQP12），且广泛表达于各个器官，它们功能上有着微妙的差异，但是在蛋白质序列上又有着同源性［5］。AQP的分布具有特异性，它参与人体多种生理功能的调节，对维持人体正常生理状态具有重要作用［6］。AQP5是最早被确定分布在唾液腺泡细胞的一种蛋白，分布于腺泡腔的顶膜、侧膜、闰管和导管上皮细胞中，构成涎腺唾液分泌的主要通道，与其他亚型一样具有水转运的特性［7］。有人研究［8］发现AQP5在腺泡顶膜表达减少，而基侧膜表达则增强，这种表达部位的“易向”可能是AQP5将水分子从腺泡细胞顶膜向基侧膜逆向转运的结果，使唾液分泌减少。本研究观察经中药干预细胞前后，激光共聚焦显微镜下细胞内标记表达AQP5的荧光强度有所增加，结合免疫印迹实验证实的AQP5蛋白表达有明显上调，说明该方对AQP5通道的调节确实是有效的，但是否像上述所说是存在AQP5蛋白的移位，尚待进一步研究。李菁等［9］发现，SS患者唇腺中AQP5蛋白在腺泡细胞腔面的分布下调，表明腺泡细胞腔面AQP5的表达与唾液流率存在正相关，腺泡细胞腔面AQP5的表达与淋巴细胞浸润灶评分呈负相关，提示在唇腺中浸润的淋巴细胞分泌的炎性因子所形成的微环境，可能是导致腺泡细胞腔面AQP5表达减少的原因之一，这和我们之前推测各种炎性因子与SS之间存在的紧密联系相印证，在之后的实验中我们将进行具体验证。SS患者唾液腺中已发现诸多影响唾液流率降低因素，包括有促进炎症进展细胞因子IL、TNF、基质金属蛋白酶（MMP）、凋亡抑制因子（Survivin）、巨噬细胞炎症蛋白趋化因子（MIP）等。目前证实，在SS患者受累外分泌腺的淋巴细胞浸润灶中高表达细胞因子可最终导致腺泡破坏，由此目前也陆续有一些针对这类细胞因子的拮抗剂被尝试用来治疗SS［10］。

此次的研究我们猜想SS与M3R也存在不可分割的联系，这源于有人发现M3R抗体是存在于SS患者血清中的一种自身抗体，它可以阻断乙酰胆碱能神经信号的有效传递，引起腺上皮细胞的分泌功能低下。当腺体受到刺激时，就会释放乙酰胆碱和神经肽等物质，结合并激活M3R，从而引起颌下腺的损伤、血流反应变慢和唾液输出量的减少，同时亦可阻断腺泡内AQP5的正常分布，导致涎腺分泌减少，同时还可激活磷脂酶C信号传导通路，增加腺体局部NO水平，破坏涎腺组织结构［11-13］。M3R属于G蛋白偶联受体超家族，是由460~590个氨基酸组成的一种单链跨膜糖蛋白，该家族目前有M1R～5R 5个成员，在体内主要参与肌肉收缩调节、呼吸、运动、体温调节、学习、记忆等重要的生理功能，是体内重要的受体之一［14］。目前诸多研究表明，M3R在外分泌腺腺体功能中有着举足轻重的地位，其在外分泌腺如唾液腺和泪腺中表达，能调节唾液腺和泪腺的副交感神经活动，从而影响外分泌腺体的分泌功能。本研究发现，益气养阴祛瘀方药可以调节M3R通道，抑制腺体激发过程中乙酰胆碱的分泌，从而有效保护腺体损伤，防止SS的发生。

总的说来，M3R和AQP5可调节水分子转运，主要维持外分泌腺腺体的正常分泌与输出，当SS导致唾液腺严重破坏时，M3R和AQP5在各个部位分布情况亦会随之发生改变，导致机体水转运失代偿，从而引起唾液分泌与输出减少。有实验研究也表明，使用M3毒蕈碱乙酰胆碱受体的激动剂西维美林处理腺体组织或细胞后，可以促使AQP5与脂质筏从胞内囊泡转移至细胞顶膜（管腔侧细胞膜）［15］，通过增加膜上蛋白的数量而快速调节对水的通透［16］。本次实验发现了益气养阴祛瘀方可以调节AQP5、M3R通道的作用，从而改善腺体的水分分布，维持其正常的生理功能。至于中药方剂如何具体作用于通道，以及治疗SS机制如何，将进一步研究。

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Study on the Influence of Yiqiyangyin Quyu Formulae on AQP5 and M3R Expression of Sjogren's Syndrome Submandibular Gland Cells

QIN Yuan，LIN Chongze，SUN Han，et al.
Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

Objective：To investigate Yiqiyangyin Quyu Formulae contained serum′s influence on AQP5 and M3R expression in submandibular gland cells of the patients with Sjogren′s syndrome.Methods：Different doses of SD rats Yiqiyangyin Quyu Formulae contained serum were prepared，and then given the following treatment：blank group（only contained RPMI1640 culture），blank serum+10%RPMI1640 group，medicated serum with 5%，10%，15%and 20%different concentrations+RPMI1640 culture groups，a total of six groups.After 24 hours of cell cultivation，cells were observed respectively by inverted phase contrast microscope and laser confocal microscope.AQP5 and M3R protein expression levels in cells were detected by Westernblot.Results：With the effect of Yiqiyangyin Quyu Formulae contained serum，fluorescence intensity of antibody-labeled cells was significantly enhanced observed with the laser scanning confocal microscopy.AQP5 and M3R protein expression were up-regulated detected by Western blot.AQP5 and M3R protein expression in serum contained group was significantly higher than that of the blank serum group，and the value of 10%，15%groups was higher than that of 5% dosing group（P＜0.05），with no statistically significant difference with 20%dosing group（P＞0.05）.Conclusion：Yiqiyangyin Quyu Formulae can up-regulate the expression of AQP5 and M3R protein in submandibular gland cells in a certain dose-dependent manner.

Sjogren′s syndrome；Yiqiyangyin Quyu Formulae；Containing serum；Aquaporin AQP5；M3R

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0005-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.002

2016-05-05）

国家自然科学基金资助项目（81473646）

△通信作者（电子邮箱：ossani@126.com）