熄风静宁颗粒对Tourette综合征模型大鼠脑纹状体多巴胺D2受体和多巴胺转运蛋白mRNA表达的影响*

李 燕王新征王俊宏孙 婷康珈宁

（1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.北京市朝阳区常营社区卫生服务中心，北京100024；3.河南省南阳市中医院，河南 南阳 473003）

·研究报告·

熄风静宁颗粒对Tourette综合征模型大鼠脑纹状体多巴胺D2受体和多巴胺转运蛋白mRNA表达的影响*

李 燕1王新征2王俊宏1孙 婷1康珈宁3

（1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.北京市朝阳区常营社区卫生服务中心，北京100024；3.河南省南阳市中医院，河南 南阳 473003）

目的 观察熄风静宁颗粒对Tourette综合征（TS）模型大鼠脑纹状体多巴胺D2受体（DRD2）和多巴胺转运蛋白（DAT）mRNA表达的影响。方法 Wistar雄性大鼠36只随机分为空白对照组、模型组、氟哌啶醇组、熄风静宁颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组，采用亚氨基二丙腈（IDPN）腹腔注射建立TS大鼠模型，造模后连续给药6周，采用RT–PCR法检测大鼠脑纹状体中DRD2和DAT mRNA表达的情况。结果 IDPN诱导的模型大鼠的体质量显著低于正常大鼠（P＜0.01）；给药前后熄风静宁颗粒中剂量组TS模型大鼠体质量增长与正常大鼠体质量的增长无差异；TS模型大鼠脑纹状体DRD2 mRNA与正常组比较呈现高表达（P＜0.01）；熄风静宁颗粒中、高剂量组和氟哌啶醇可降低TS模型大鼠脑纹状体DRD2 mRNA的表达（P＜0.05）；TS模型大鼠脑纹状体DAT mRNA表达与正常组比较显著增高（P＜0.01）；中药颗粒高剂量组能够降低TS模型大鼠脑纹状体DAT mRNA的表达，但氟哌啶醇作用更明显（P＜0.05）。结论 熄风静宁颗粒尚具有部分调节机体状态的作用；Tourette综合征存在多巴胺功能的亢进，熄风静宁颗粒能够通过降DRD2受体的敏感性，抑制多巴系统系统功能的亢进而发挥药物治疗的作用。

熄风静宁颗粒 Tourette综合征 多巴胺D2受体 多巴胺转运蛋白

Tourette综合征（TS）又称多发性抽动症，或抽动-秽语综合征，是一种儿童时期起病，以头面部、肢体或躯干的多发性肌肉抽动和（或）发声性抽动为特征的精神障碍性疾病。目前TS研究发现，发病机制与多巴胺D2受体（DRD2）密切相关［1-3］。TS患者存在DA释放和摄取调节的异常［4-5］，而多巴胺转运蛋白（DAT）是起调节作用的关键因素。临床上熄风静宁颗粒治疗TS具有疗效显著、副作用少的优势。探讨熄风静宁颗粒对TS模型大鼠脑纹状体DRD2和DAT mRNA的影响，明确其作用机制，对以后的临床应用具有重要的指导意义。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠36只，清洁级，雄性，4周龄，体质量80～100 g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2007-0001。分笼喂养，自由摄食饮水，温度（22±2）℃，湿度50%～70%，通风。

1.2 试药与仪器 氟哌定喘片，2 mg/片，宁波大红鹰药业股份有限公司，批准文号：国药准字H33020585，生产批号：131003。熄风静宁中药配方颗粒（辛夷花10 g，苍耳子3 g，元参10 g，板蓝根10 g，木瓜10 g，清半夏10 g，伸筋草20 g，钩藤15 g，菊花15 g，白芍15 g，全蝎3 g，珍珠母30 g，酸枣仁30 g，炙甘草10 g），由北京康仁堂药业有限公司制备。亚氨基二丙腈（IDPN）购自美国Sigma公司；超纯RNA提取试剂盒，批号CW0581；HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，批号CW0744；SYBR Green PCR Mixtur，批号 CW0957；Dnase 1，批号CW2090，以上均购自北京康为世纪生物有限公司。荧光定量PCR仪，ABI7500；高速冷冻离心机，Hettich德国；电泳仪，北京六一仪器厂；电泳槽，北京六一仪器厂；凝胶成像仪，Tanon-6600天能公司；分光光度计，UV-2000上海尤尼柯公司；移液器（不同量程），Eppendorf。

1.3 分组与造模 大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字法分为空白对照组、模型组、氟哌啶醇组、熄风静宁颗粒低、中、高剂量组，每组6只。除空白对照组外，其余5组小鼠腹腔注射IDPN，150 mg/kg，空白对照组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液，每日1次，连续7 d。注射IDPN及干预治疗15 min后开始观察大鼠行为活动，包括：嗅、咬、舔（不包含理毛）、迅速移位、挖洞、急速跳跃等。由熟练掌握大鼠刻板行为并能准确评分但不熟悉组别的实验人员每天观察动物行为并评分。评分≥1分可判定造模成功。评分标准参考Napier and Istre报道［6］。

1.4 干预措施 造模7 d后，正常对照组与模型组灌胃蒸馏水10 mL/kg，熄风静宁颗粒颗粒低、中、高剂量组分别按1.2、2.4、4.8 g/kg体质量给予熄风静宁颗粒混悬液，氟哌啶醇组按0.5 mg/kg体质量给予氟哌啶醇混悬液，每天1次，各组均连续灌胃6周。

1.5 标本采集与检测 1）体质量测定。于实验开始第1天，及以后每7天为1个周期，测定大鼠的体质量并记录。2）标本采集。处死前1天禁食，不禁水。末次给药60 min后，3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，快速断头取脑，冰上剥离纹状体，液氮速冻后迅速转移至于-80℃冰箱冻存 （参照Paxinos和Watson鼠脑立体定位图谱及李耀宇成年大鼠纹状体三维结构定位纹状体）［7-8］。3）样本检测。引物设计：按NCBI primerblast和primer5.0进行设计。目的基因RT-PCR检测引物，引物序列见表1。总RNA提取：用超纯RNA提取试剂盒提取脑组织样本中总RNA，实验操作按产品说明书进行，并进行浓度测定，总RNA-80℃保存，防止降解。反转录：每样本抽取2 μg的总RNA，用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录，实验操作按产品说明书进行，合成的cDNA于-80℃冰箱保存。使用SYBR Green PCR Mixtur试剂盒，应用ABI7500型实时检测扩增仪，通过两步法PCR反应程序实现对mRNA的定量表达。反应条件为：95℃预变性10 min，59℃复性和延伸60 s，95℃变性10 s，共45个循环。确认溶解曲线和扩增曲线，记录每个基因的Ct值。运用2-△△ct方法进行相对定量分析，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）实验组-（Ct目的基因-Ct管家基因）对照组。实验至少重复3次。

表1 实时荧光定量PCR检测中DAT、DRD2引物序列

1.6 统计学处理 应用SPSS18.0软件包，计量资料以（）表示，正态分布。组间比较，采用单因素方差分析，方差齐，LSD检验；方差不齐，Games-Howell检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠不同时期的体质量比较 见表2。造模后初期与后期，各组TS模型大鼠体质量与正常大鼠体质量存在显著差异（P＜0.01），随着时间的推移这种现象不变。熄风静宁颗粒中剂量组大鼠体质量的增长与正常组体质量的增长差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠不同时期的体质量及增长值比较（g，）

表2 各组大鼠不同时期的体质量及增长值比较（g，）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

组别 n正常组 6模型组 6氟哌啶醇组 6初始 造模后 给药6周后 体质量增长值113.00±9.63 175.33±13.11 394.00±42.09 218.67±31.23 118.00±6.57 137.00±9.96**324.33±24.37**187.33±26.39*124.17±5.85 129.83±8.70**312.50±22.65**182.67±20.10*熄风静宁颗粒低剂量组 6 120.33±2.88 131.00±14.94**320.00±30.36**189.00±16.16*熄风静宁颗粒中剂量组 6 125.17±3.76 133.33±8.55**327.83±33.21**194.50±26.88熄风静宁颗粒高剂量组 6 117.00±6.66 117.17±8.09**303.17±19.04**186.00±20.22*

2.2 各组大鼠脑纹状体DRD2 mRNA表达比较 见表3。模型组大鼠脑纹状体DRD2 mRNA较正常组表达显著增加（P＜0.01）；熄风静宁颗粒中、高剂量，和氟哌啶醇可降低DRD2 mRNA的表达，具有统计学差异（P＜0.05）。

表3 各组大鼠脑纹状体DRD2 mRNA表达水平比较（）

表3 各组大鼠脑纹状体DRD2 mRNA表达水平比较（）

与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。与氟哌啶醇组比较，▲P＜0.05。

组别 n正常组 6模型组 6氟哌啶醇组 6 DRD2 mRNA DAT mRNA 0.93±0.05 0.83±0.11 1.28±0.11**2.30±0.33**1.08±0.08△1.25±0.12**△△熄风静宁颗粒低剂量组 6 1.25±0.17*2.50±0.69**熄风静宁颗粒中剂量组 6 1.08±0.10△1.79±0.25**熄风静宁颗粒高剂量组 6 1.07±0.26△1.67±0.18**△▲

2.3 各组大鼠脑纹状体DAT mRNA表达的影响 见表3。造模后各组TS模型大鼠DAT mRNA表达均较正常组增高（均P＜0.01）。熄风静宁颗粒高剂量组能够降低TS模型大鼠脑纹状体DAT mRNA的表达，差异有统计学意义（P＜0.05），但氟哌啶醇作用更明显（P＜0.01），两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

TS是儿童期常见的一种神经精神障碍性疾病，男女发病比例为5∶1，国外学者报道［9］患病率为0.05%～3.0%不等。近年来，研究显示TS有增多的趋势，长时间的抽动发作可给患儿带来严重的压力及疲劳感，影响患儿的学习及生活，且部分患儿的病情可延续至成年，甚者还有部分患者抽动症状可以持续一生，严重影响患者就业、生存等社会行为。TS发病机制研究普遍认为与多巴胺系统的过度活跃有关，但是其确切的机制尚不清楚。

熄风静宁颗粒是我国著名中医儿科专家刘弼臣教授治疗TS的经验方，主要由辛夷花、苍耳子、玄参、板蓝根、木瓜、法半夏、伸筋草、天麻、钩藤、白芍、蝉蜕、僵蚕、全蝎等药物组成。前期研究证实其具有改善TS模型大鼠刻板行为活动及调节脑纹状体多巴胺DA含量的作用。本实验在对大鼠体质量观察中发现，IDPN作为神经毒素，可以影响大鼠体质量的增长。但是熄风静宁颗粒（中剂量）在发挥治疗作用的同时，可以对抗这种毒副作用。这与前期研究，熄风静宁颗粒具有免疫调节的药效学具有一致性［10］，推测熄风静宁颗粒尚具有部分调节机体的状态的作用，有利于疾病的治疗。这需要以后更深入的研究证实。

TS患者纹状体内多巴胺神经过度支配或突触后DRD2超敏感是目前公认的TS发病的神经生物化学因素。DA分别与纹状体内神经元上的DRD1和DRD2结合，最终使大脑皮质运动区兴奋或去抑制，而产生运动［11］。目前多项研究证实TS患者脑内DRD2受体的表达较正常人增高，如Yoon等［12］通过研究发现TS患儿额部大脑皮层DRD2密度分布较正常儿童增高，Minzer等［13］也发现TS患者的前额皮质DRD2的分布密度增加是正常对照组的1.4倍。本实验结果显示，IDPN诱导TS模型大鼠脑纹状体DRD2 mRNA表达较正常组显著增加，与上述研究结论一致，提示TS模型大鼠脑内存在DRD2数目上调，呈现DRD2超敏感状态，与目前认为的TS病理生理改变一致。IDPN是一种中枢神经毒素，抽动的造模机制主要是通过破坏了锥体外系的DA系统，产生持久的降低DA浓度的效应，使动物在生长发育过程中出现DA受体超敏现象，导致动物出现刻板行为［14］，这一诱导机制在本实验中得到验证。氟哌啶醇是一种DRD2拮抗剂，是治疗TS的代表性药物，通过作用于DRD2受体，使DA不能与DRD2结合，从而降低DA神经元的活性而抑制大脑皮质运动区的兴奋性，缓解抽动症状。本实验中氟哌啶醇和熄风静宁颗粒中、高剂量可降低TS模型大鼠脑纹状体DRD2 mRNA的表达，证明了熄风静宁颗粒具有类似氟哌啶醇DRD2拮抗剂的作用，通过降低DRD2受体的敏感性，进而调节多巴胺系统的功能，达到临床治疗的目的。

DAT是多巴胺神经元末梢突触前膜的膜蛋白，其功能是多巴胺神经元发放神经冲动后，再摄取突触间隙的DA，终止细胞间的信息传导。DA总量的80%经DAT转运进入细胞内，然后再释放利用。DAT专一定位于多巴胺合成神经元，被认为是多巴胺能神经元的独特标志，DAT的变化可以在一定程度上反映多巴胺系统的功能。Yoon［11］、Minzer［13］发现TS患者脑内DRD2增高的同时，也存在DAT的增高。本研究发现造模后TS模型大鼠脑纹状体DAT mRNA表达显著增加，与上述研究结果一致，推测DAT表达增加的原因可能与TS患者体内存在多巴胺系统功能的亢进，引起突触前膜多巴胺转运体代偿性升高有关。这一结果，支持TS多巴胺系统功能亢进的发病理论。目前有研究发现氟哌啶醇能抑制纹状体DAT基因表达［15-16］，在本实验中也得到证实，氟哌啶醇和高剂量熄风静宁颗粒降低了DAT mRNA的表达，而且氟哌啶醇作用更显著。这种降低趋势说明了两者在一定程度上抑制了TS多巴胺系统功能的亢进，支持临床疗效的显著性。

综上所述，熄风静宁颗粒能够通过降DRD2受体的敏感性，进而抑制多巴胺系统功能的亢进，发挥药物的治疗作用，为以后更广泛的临床应用和开发研究提供了依据。而且熄风静宁颗粒还尚具有部分调节机体状态的作用，这有待以后更进一步的研究证实。

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Effects of Xifeng Jingning Granule on Dopamine Receptor D2 and Dopamine Transporter mRNA Expression in Striatum of Tourette Syndrome Rat

LI Yan，WANG Xinzheng，WANG Junhong，et al.
Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China.

Objective：To investigate the mRNA expression of dopamine receptor D2（DRD2）and dopamine transporter（DAT）in rat brain striatum of tourette syndrome model.Methods：Male Wistar rats（n＝36）were randomly divided into 6 groups：control group，model group，haloperidol group，low-dose of Xifeng Jingning granule group，middle-dose of Xifeng Jingning granule group and high-dose of Xifeng Jingning granule group.The tourette syndrome model was established in rats by intraperitoneal injection of iminodipropionitrile（IDPN）.After modeling the rats were given medicines for 6 weeks.The mRNA expression of dopamine receptor D2（DRD2）and dopamine transporter（DAT）in rat brain striatum of Tourette Syndrome model were investigated by using real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）.Results：The weight of tourette syndrome rats by intraperitoneal injection of iminodipropionitrile was significantly lower than normal rats（P＜0.01）.There was no difference on rat weight gain between middle-dose of Xifeng Jingning granule group and control group（P＞0.05）.Compared with control group，dopamine receptor D2 mRNA in striatum of tourette syndrome rats showed higher expression（P＜0.01）.Middle-dose，high-dose of Xifeng Jingning granule group and haloperidol group could reduce the expression of dopamine receptor D2 mRNA in tourette syndrome rat striatum （P＜0.05）.Compared with control group，dopamine transporter mRNA in tourette syndrome rat striatum showed higher expression（P＜0.01）.Dopamine transporter mRNA expression in tourette syndrome rat striatum in high-dose of Xifeng Jingning granule group and haloperidol group could get reduced，but more obviously in haloperidol group（P＜0.01）.Conclusion：Xifeng Jingning granule has a partial role in regulating body state；Tourette syndrome may induce overactivity ofdopamine system.The therapeutic effect of Xifeng Jingning granule can be implemented regulating the sensitivity of postsynaptic dopamine receptors，and then reducing overactivity of dopamine system.

Xifeng Jingning granule；Tourette Syndrome；Dopamine receptor D2；Dopamine Transporter

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0023-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.007

2016-10-10）

高等学校博士学科点专项科研基金项目（20120013120011）