离体培养基诱导型愈伤组织形成的分子机制

张 腾 张 伟 于振林

(华东师范大学生命科学学院 上海 200241)

1 愈伤组织概述

20世纪初，德国植物学家Haberlandt根据细胞学理论，提出高等植物细胞具有全能性的观点，而后美国科学家White发明了离体培养愈伤组织技术，并在烟草组织培养过程中发现芽的形成，从而证实Haberlandt的论点，同时也完善了愈伤组织的定义：高度分化的细胞或组织经脱分化过程形成的无序薄壁细胞群[1]。

近年来，科学家根据是否存在明显的器官从头再生能力，将愈伤组织分为两类：离体培养基诱导型(CIM-callus)和伤口诱导型(wound-callus)。离体培养基诱导型愈伤组织指的是植物离体的外植体材料在植物激素(生长素、细胞分裂素)的诱导下可以形成并完成继代培养的一类愈伤组织，这类愈伤组织的形成过程与根的从头再生过程十分相似，也会表达不定根形成过程中的标志基因，如SCR基因、WOX5基因等。对于伤口诱导型愈伤组织而言，可以形成这类愈伤组织的植物细胞种类较多(如髓细胞、维管柱细胞、皮层细胞等)，并常含有大量的植物抗菌素和病原菌相关蛋白，参与植物的防御与修复过程。这类愈伤组织也有可能发育成完整植株，但这主要归结于植物细胞具有潜在的全能性，其在形成过程中并不会表达不定根形成过程中的相关基因[2]。两类愈伤组织的形成及分化的分子信号通路是不一样的，本文主要介绍近年来研究比较活跃的离体培养基诱导型愈伤组织形成的分子机制的研究进展。

2 WOX基因与根的从头再生过程

与动物细胞不同的是，植物具有细胞、组织或器官再生，并再次形成一个完整植株的能力[3]。器官从头再生主要指的是受伤或离体的植物器官重新再形成不定根或不定芽的过程[4]。在根从头再生的过程中，植物细胞经历了两次命运的转变：第一次是由原形成层细胞向根母细胞发生转变；第二次则是由根母细胞向根原基细胞转变，根原基细胞不断分裂增殖最终形成不定根。

WOX(WUSCHEL-related homeobox)转录因子家族是植物特有的一类同源框转录因子, 一般在植物细胞增殖分化较为旺盛的区域发挥重要的调控作用。其中，WOX4基因主要在原形成层及形成层中表达，可以维持维管形成层形态以及促进形成层细胞的增殖，因而常作为原形成层细胞的标志基因。而WOX5则是根原基细胞的标志基因，一般位于根尖分生组织中，常与其他WOX家族基因协同维持着干细胞的稳定性[5，6]。WOX11主要分布在根尖分生组织、根部原生木质部细胞中，常用于根母细胞的标记。

研究发现，在拟南芥叶片外植体诱导形成不定根的过程中，起始阶段，植物的离体叶片伤口附近的WOX4基因大量表达，该处原形成层细胞大量增殖；一段时间后，WOX11基因在之前的原形成层部位开始大量表达，原形成层细胞开始分化为根母细胞，发生第一次细胞命运转变；同时WOX5开始大量表达，之前的根母细胞已经分化为根原基细胞，完成了第二次的细胞命运转变[7]。

此外，在根的从头再生过程中，WOX11是不定根生长发育的关键调节基因。在水稻中的研究表明，WOX11基因的低表达或缺失突变体都会使不定根的数目减少并且减缓其生长速率；相反，WOX11的过表达则会使不定根提早产生，并且相应的生物量也显著增加[8]。

3 WOX基因与离体培养基诱导型愈伤组织的形成过程

3.1 与根的从头再生过程十分相似 愈伤组织一直被认为是植物器官外植体脱分化后形成的具有分化潜能的无序细胞团。然而，对于离体培养基诱导型愈伤组织而言，其结构并非以往研究认为的无序杂乱状态。例如，在对拟南芥芽或根的外植体愈伤组织进行离体培养基诱导过程中，这些愈伤组织来源于木质部附近的中柱鞘细胞，与不定根的结构十分相似。相关研究进一步在转录水平上证明：这种类型的愈伤组织在形成过程中，会有与不定根形成过程中相同的标志基因表达[9]。

徐麟等利用拟南芥叶外植体，证实在离体培养基诱导型愈伤组织形成过程中，WOX4、WOX11、WOX5发生了时空特异性表达，而这一过程与根的从头再生过程十分相似[7]。这一结果也证明愈伤组织是通过根原基细胞不断分裂增殖、规则排列形成的。由此可见，WOX家族基因在离体培养基诱导型愈伤组织形成过程中起到类似开关一样的调控作用。

3.2 转分化的作用 由上可知：离体培养基诱导型愈伤组织的形成过程可能与根的从头再生分享着相似的分子信号通路，而并非一概而论的脱分化过程。所谓脱分化，即细胞重新进入细胞周期，由已经高度分化的状态退回到干细胞或者干细胞样细胞状态(可以长期自我更新并且可以继续分化成一种或多种细胞类型)[10]。离体培养基诱导型愈伤组织经实验证明其细胞状态属于根原基细胞，而非干细胞，即原本高度分化的成熟细胞，转变其正常的细胞命运，向其他分化或未分化方向的细胞转化，而非由成熟细胞直接脱分化成为干细胞或者干细胞样的细胞状态。因此，用“转分化”可以更贴切地体现离体培养基诱导型愈伤组织的形成过程。

3.3 复杂的分子网络 无论是根从头再生过程，还是愈伤组织形成过程，伤口信号都是整个过程的起点[11]。伤口信号可以通过一系列分子通路招募大量的生长素和细胞分裂素(具体的分子信号通路未知)[12]。在这个过程中，生长素发挥了重要作用。在植物体内，生长素受AUX/IAA和ARF蛋白家族调控，促进AUX/IAA蛋白降解，进而激活生长素响应因子ARF7/19，启动下游的WOX11—LBD16/17/18/29—WOX5信号通路，最终形成愈伤组织或根原基[1]。除了植物激素诱导的上述信号通路外，细胞周期调控的相关基因(CDK、CYC等)、愈伤组织形成的负调控基因(例如，细胞壁形成调控基因等)都会参与其中，共同构成复杂的愈伤组织形成的分子网络。

4 展望

离体培养基诱导型愈伤组织研究的结果，一方面有助于新的基因标记的开发，可以通过检测WOX11的表达情况来确定愈伤组织形成情况；另一方面有利于植物遗传体系的建立，对植物诱导过程进行监控，从而帮助确定愈伤组织的最佳活力，为濒危植物的研究与保护提供帮助。植物愈伤组织与根原基细胞的关系的揭示，也为愈伤组织形成的分子机制提供一个新的研究思路。