木薯渣堆肥过程中相关指标的变化及细菌群落特征

罗 佳,张 苗,严少华,张志勇,张振华*

(1.江苏省农业科学院 六合动物科学基地,江苏 南京 210014;2.江苏省农业科学院 农业资源与环境研究所,江苏 南京 210014)

木薯渣堆肥过程中相关指标的变化及细菌群落特征

罗 佳1,张 苗1,严少华1,张志勇2,张振华2*

(1.江苏省农业科学院 六合动物科学基地,江苏 南京 210014;2.江苏省农业科学院 农业资源与环境研究所,江苏 南京 210014)

利用条垛式堆肥对木薯渣进行40 d的发酵处理,并对发酵过程中温度、碳氮比、种子发芽指数及细菌群落结构进行检测。试验结果表明：木薯渣可以直接进行堆肥发酵,在发酵3 d后堆体温度即可达到50 ℃以上,高温期持续1个月左右;经过40 d的发酵后堆体的碳氮比降至20以下;经不同发酵阶段堆体处理的种子的发芽指数逐渐升高,最后升至87.4%。对堆体细菌菌群的高通量测序分析结果表明：堆体的细菌群落结构在堆肥发酵不同阶段存在差异,在发酵前期部分细菌群落差异较大,在发酵后期细菌群落结构趋于稳定；在木薯渣堆体中存在大量与纤维素分解相关的Firmicutes门和Bacteroidetes门的菌群。

木薯渣;堆肥;指标；细菌；群落结构

近年来,我国每年产生有机固体废弃物超过100多亿t,其中大部分无法得到很好的利用,泛滥成灾、垃圾围城现象越来越严重,这些有机固体废弃物已经成为日益严重的生态环境灾难[1]。有机固体废弃物含有大量的作物生长所需的氮、磷等营养元素[2]；如果无法得到合理利用，则这些营养元素将成为河流湖泊等水体和自然环境的污染源。当前有机固体废弃物最方便的资源化利用途径是制成有机肥。而大力发展有机固体废弃物肥料化对于我国农业部推动的“减肥减药”行动,2020年实现我国化肥使用量的零增长具有十分重要的意义。大量研究表明,长期施用有机肥可以改善土壤理化性质、提高农作物产量、增强土壤稳定性[3-5],同时对土壤中的C、N有固定作用,可以减少温室气体的排放[6-7]。

木薯渣是生产加工淀粉或乙醇后的副产品,每年我国产生的大量木薯渣资源无法获得有效利用,这些废弃物中含有大量的淀粉、木质纤维素(包括半纤维素、纤维素和木质素)以及少量氰化物,滞留于环境中,会污染水体和生活环境。目前国内对木薯渣的应用主要有:生产单细胞蛋白[8]；作为动物饲料[9]，但是因为木薯渣中含有一定量的氰化物等有毒物质[10],所以也限制了其用作动物尤其是单胃动物饲料;培养食用菌[11]。木薯渣中大部分物质为碳水化合物,有机物的含量达到90%以上(以干物计),含有较多的粗纤维,粗蛋白含量低,具有较高的碳氮比。但是上述途径只能解决部分木薯渣的出路问题,还有大量的木薯渣得不到解决。本研究通过监测木薯渣条剁式堆肥发酵过程中理化性状及微生物群落变化情况揭示木薯渣肥料化发酵动态参数,旨在为木薯渣肥料化利用提供理论依据和技术参数。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验在江苏省农业科学院六合动物科学基地有机肥场进行,木薯渣来自江苏省灌南县新冠酒业有限公司,其基本性状为总氮1.94%、总磷0.26%、总钾0.97%、有机质79%、pH 7.77、EC 4.9 ms/cm。试验木薯渣重量为40 t,条剁式发酵,发酵堆长40.0 m,高1.2 m。采用翻抛机翻堆,每隔2 d翻堆一次。试验周期为40 d。

1.2 样品的采集与测定

温度测定：每天9:00时测定堆温,测量时将温度计插入堆体表面30～40 cm处,测定堆体前、中和后3个不同位置的温度,取其平均值作为当天堆体温度；同时记录周围环境温度。

样品采集：每间隔10 d采集堆肥样品一次,采集时用铁锹挖开堆体剖面,距离表层0～20 cm为外层,20～40 cm为中层,40 cm以上为内层,分层采集样品,低温冷冻保存。将外层、中层和内层样品混合,做成3个混合样品,分别采用常规方法[12]测定有机碳、总氮、总磷等常规指标。分层采集样品(首次样品未发酵，采集时不分层)5次，分别进行高通量测序分析，其中首次样品编号为First;第二次采样外层编号为Second-W,中层为Second-Z,内层为Second-N;第三次采样外层为Third-W,中层为Third-Z,内层为Third-N;第四次采样外层为Four-W,中层为Four-Z,内层为Four-N;第五次采样外层为Five-W,中层为Five-Z,内层为Five-N。

种子发芽指数测定：将待测新鲜堆肥样品与去离子水按照1 g∶10 mL的比例混合,震荡1 h后,用移液管取10 mL提取液到铺有滤纸的培养皿中,将20颗小青菜种子均匀地放入其中,在30 ℃下培养48 h，然后测定发芽率和根长,每处理重复3次,以去离子水为对照。按照以下公式计算种子发芽指数[13]:发芽指数=(处理组发芽率×处理组根长)/(空白组发芽率×空白组根长)×100%。

1.3 高通量测序分析

用于细菌高通量测序的堆肥样品DNA采用引物Forward primer 5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′和Reverse primer 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′对细菌16S rRNA V4和V5区进行扩增。PCR反应程序为95 ℃ 2 min,94 ℃变性20 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环;最后72 ℃延伸2 min。取5 μL的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,检测合格后由上海天昊生物科技有限公司采用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序和分析。进行高通量测序后,使用UPARSE软件以97%为划定阈值对16S rRNA序列划分操作分类单元(OTU)。通过Microsoft Excel for Windows 2010软件对OTU百分含量作图分析。

1.4 数据的分析与统计

对试验数据使用Excel 2010和SPSS统计分析软件进行单因素方差分析,比较各组数据之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 木薯渣堆肥温度的变化情况

温度是堆肥腐熟效果分析的重要指标。经过连续40 d的监测,温度变化情况见图1,堆体开始温度只有室温17 ℃,经过快速升温期后温度在第3天上升至50 ℃以上,高温期持续27 d后进入降温期，温度逐渐降低。堆肥温度持续27 d超过50 ℃,能够有效杀灭木薯渣中的病原菌、虫卵及草籽,高温期长度完全符合有机物料无害化处理标准[14]。

图1 木薯渣堆肥过程中堆体温度和环境温度的变化

2.2 木薯渣不同堆肥阶段碳氮比的变化

堆肥的碳氮比(C/N)被普遍认为是检测堆肥腐熟的一个重要指标,通常认为C/N由堆肥初期的25～30下降到20以下为堆肥腐熟的主要标志[15]。如图2所示,木薯渣初始C/N为25.91,十分适合堆肥发酵,能够快速升温;随着堆肥发酵的进行,木薯渣堆体的C/N呈下降趋势,10 d后C/N下降为23.5,40 d后C/N下降到20以下,表明木薯渣已经基本腐熟。

2.3 木薯渣不同阶段的堆肥对种子发芽指数的影响

种子发芽指数是衡量堆肥产品质量和腐熟度的重要指标,也是间接表征堆肥的植物毒性的一个指标：当种子发芽指数>50%时,认为堆肥产品的植物毒性处于较低水平;当种子发芽指数>80%时,可认为堆肥处于完全腐熟状态[16]。从图3可以看出：木薯渣初始发酵时种子发芽指数为55.25%,之所以超过50%，是因为木薯渣本身为酒精发酵后的残渣,具有较低水平的植物毒性；随着堆肥发酵的进行，种子发芽指数呈上升趋势,经过30 d的发酵，种子发芽指数已经接近80%,而到40 d时种子发芽指数已经达到87.4%,说明此时堆肥处于完全腐熟状态。

图2 木薯渣堆肥过程中堆体碳氮比的变化

图3 木薯渣堆肥过程中种子发芽指数的变化

2.4 木薯渣不同堆肥阶段细菌高通量测定分析

通过对木薯渣堆肥不同批次13个样品16S rRNA V4和V5区的扩增测序,共获得690735条有效序列,根据barcode标签进行样品序列拆分,在97%相似度下将获得的序列进行物质分类的OTU分析,一共获得2068个OTU,说明样品中含有丰富的细菌。样品中细菌数量占比超过1%的细菌主要来自Proteobacteria(变形菌门)、Planctomycetes(浮霉菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)及Firmicutes(厚壁菌门);它们在纲水平上主要属于Deltaproteobacteria(变形菌纲)、Planctomycetia(浮霉状菌纲)、Sphingobacteriia、Acidobacteria(酸杆菌纲)、Gammaproteobacteria(γ-变形菌纲)、Anaerolineae(厌氧绳菌纲)、Clostridia(梭菌纲)、Cytophagia(噬纤维菌纲)等纲。

采用R语言制作热点图(heatmap),结果见图4。由图4可以看出堆肥样品间与细菌间的网状结构。样本数据按照横坐标聚类,即按照堆肥样品聚类,堆肥样品可以分为三大类：未发酵样品First单独为一类；后期堆肥样品主要分为二类。样本按照纵坐标聚类,即细菌在纲水平上的聚类,可以将细菌OTU量相关聚在一起,可以分为三大类：相对丰度高的为一类；相对丰度差的分为二类。

同时对样品进行主成分分析(PCA),分析不同样品OTU组成的差异,结果(图5)表明：样品First与其他样品距离较远,差异较大；样品Second-W的细菌群落结构与样品First最相似；样品Second-Z、Third-Z和Third-N的细菌群落结构比较相似；样品Third-W和Four-W的群落结构比较接近；样品Four-Z、Four-N、Five-W、Five-Z、Five-N的群落结构比较接近；与初始样品First群落结构差距最大的是样品Third-Z和Third-N。说明木薯渣堆肥发酵过程中细菌群落结构变化逐渐加大,但在进入发酵末期后细菌群落结构趋于稳定。

3 讨论

肥料化是解决目前日益剧增的有机固体废弃物问题的主要途径,堆肥发酵过程中最常用的衡量堆肥腐熟度的指标是温度、碳氮比和种子发芽指数[17-18]。有机物料需要经过高温腐熟才能形成有机肥,高温腐熟过程不仅可以减少有机肥施用后烧苗的现象,同时也杀灭有机物料中大量的致病菌和寄生虫[19]。堆肥腐熟需要经过升温和降温的过程,高温阶段是堆肥过程中的重要阶段,堆肥温度持续3 d超过55 ℃将杀死堆体中的大部分病原菌[13]。虽然碳氮比在一定程度上可以指示堆肥的腐熟度,但是对于本身碳氮比比较低的物料不适用,不适合用于衡量工厂化堆肥的腐熟度[15]。种子发芽指数是一种可靠性较好、可以衡量堆肥产品质量和腐熟度的重要指标,被广泛应用[20]。本研究测定木薯渣堆肥发酵过程中温度、碳氮比和种子发芽指数,发现经过40 d的发酵后木薯渣完全腐熟。

堆肥的腐熟过程与微生物的降解活动密切相关,细菌是堆肥过程中数量最多的微生物群落,在堆肥发酵过程中起到十分重要的作用。相关研究表明堆肥中细菌数量一般呈现高-低-高的趋势[20]或者低-高的趋势[21],这种变化差异可能与堆肥过程中升温速度和检测时间有关系[22]。目前,大量的细菌菌群在堆肥中被检测出来,例如Blanc M等[23]通过分子生物学方法在堆肥中发现了大量的Thermusthermophilus、Bacillusspp.、Hydrogenobacterspp.； Garcia R等[24]从堆肥中分类出多种硫氧化细菌；Actinobacteria、γ-Proteobacteria、Xanthomonascampestris、Pseudomonas、Lactobacillus、Paracoccusthiocyanatus等细菌均在堆肥发酵过程中被发现[25-27]。本研究通过高通量测序发现堆肥中存在大量的不同种类细菌,主要属于Proteobacteria(变形菌门)、Planctomycetes(浮霉菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)及Firmicutes(厚壁菌门)等门。相关研究表明： Firmicutes门的微生物可以利用胞外酶分解纤维素、半纤维素和木质素,并且还可以水解糖和蛋白质,产生各种酸、醇和脂类; Bacteroidetes门的部分微生物可以分解纤维素、半纤维素和木质素[15]。本研究检测出Firmicutes门和Bacteroidetes门的细菌占优势,这可能与木薯渣发酵过程中纤维素的降解过程有关。

在堆肥过程中有大量的微生物参与其中,微生物的种类繁多,甚至在堆肥的不同原料、不同时期和堆体的不同深处微生物种类也存在较大的差异。刘健斌等[22]研究表明污泥高温堆肥过程中不同时期细菌群落结构差异明显,高温菌群和常温菌群交替变化。李凤等[28]比较了农业废弃物与城市餐厨垃圾堆肥之间微生物的差异,结果显示两者在优势菌群上存在Bacillusmegaterium和Phanerochaetechrysosporium两个相同的菌群,但是另有大部分菌群是两者各自独有的优势菌群。本研究对不同时期不同部分的堆肥样品进行高通量测试,发现堆体初始样品的细菌群落与发酵后样品存在很大差异,而且发酵前期样品和发酵后期样品的细菌群落也存在差异;发酵前期在堆体内层、中层、外层细菌群落差异较大,发酵后期堆体内层、中层、外层细菌群落差异较小。

综上所述,木薯渣可以直接进行堆肥发酵,在发酵过程中堆体经过升温、高温期和降温过程,堆体的碳氮比逐渐降低,经堆体处理后种子的发芽指数逐渐升高,最终形成腐熟的有机肥。细菌群落结构在木薯渣堆肥发酵不同阶段存在差异,在发酵前期堆体部分细菌群落差异较大,在发酵后期细菌群落结构趋于稳定且变化较小。

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(责任编辑:黄荣华)

Related Index Changes and Bacterial Community Characteristics in Composting Process of Cassava Residue

LUO Jia1, ZHANG Miao1, YAN Shao-hua1, ZHANG Zhi-yong2, ZHANG Zhen-hua2*

(1. Luhe Animal Science Station, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. Institute of Agricultural Resources and Environmental Sciences, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

In this study, the composting of cassava residue was carried out through 40-d windrow fermentation, and the fermentation temperature, C-N ratio, seed germination index, and bacterial community structure in the composting process were detected. The results showed that: cassava residue could be directly used for compost fermentation, the compost temperature rose to more than 50 ℃ after 3-d fermentation, and the high temperature lasted for about 1 month; the C-N ratio of the compost reduced to below 20 after 40-d fermentation; the germination index of seeds treated with the solution of the compost at different fermentation stages increased gradually, and finally rose to 87.4%. The high-throughput sequencing analysis showed that the bacterial community structure of cassava residue compost was different at various fermentation stages, and some bacterial communities changes greatly in the earlier fermentation period, but all bacterial communities had little changes in the later fermentation period. There were a large number of bacteria belonged to Firmicutes and Bacteroidetesas in the cassava residue compost, which were related to the decomposition of cellulose.

Cassava residue; Compost; Index; Bacteria; Community structure

2016-10-16

公益性行业(农业)科研专项(201203050-6);江苏省自主创新基金[CX(14)2132];江苏省六大人才高峰项目(NY-033)。作者简介：罗佳(1982─),男,江苏滨海人,博士,主要从事污染物治理及资源化利用研究。*通讯作者:张振华。

S141.4

A

1001-8581(2017)02-0058-05