1株产木聚糖酶菌株的鉴定、产酶条件的优化及酶学性质初探

姚 健,陈庆隆,张 诚,钟国祥,王洪秀,马吉平

(江西省农业科学院 农业应用微生物研究所,江西 南昌 330200)

1株产木聚糖酶菌株的鉴定、产酶条件的优化及酶学性质初探

姚 健,陈庆隆,张 诚,钟国祥,王洪秀,马吉平

(江西省农业科学院 农业应用微生物研究所,江西 南昌 330200)

以木聚糖为唯一碳源,从腐败的甘蔗叶中分离木聚糖降解菌,结合木聚糖水解圈法及胞外酶活测定(DNS)法筛选到1株高产木聚糖酶的菌株ZJ-1。16S rRNA序列及系统发育分析结果表明ZJ-1菌株与链霉菌(登录号: KC856931.1)处于同一最小分支,且与多株链霉菌属菌株的相似性均达到98%以上,故将菌株ZJ-1初步鉴定为链霉菌(Streptomycessp. ZJ-1)。在最适产酶条件(碳源CMC-Na、氮源蛋白胨、初始培养pH 6.5～10.0、培养温度25 ℃、连续培养6 d)下，ZJ-1所产木聚糖酶的活性达40.0 U/mL。ZJ-1所产木聚糖酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH值为6.0。

木聚糖酶；链霉菌；菌株鉴定;产酶条件优化;酶学性质

半纤维素是存在于自然界中非常丰富的资源,约占植物干重的35%,广泛存在于农副产品如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆及甘蔗渣中,在自然界中含量仅次于纤维素[1]。木聚糖是半纤维素的重要组成部分,是由β-D-吡喃型木糖单元经β-1,4-糖苷键连接构成主链,主链上带有乙酰基、阿拉伯糖残基和葡萄糖残基等多种不同的取代基,来源或分支程度不同的主侧链与不同的取代基共同构成的复杂而多样的木聚糖分子[2]。木聚糖的完全降解需要多种酶的共同参与,其中,β-1,4-内切木聚糖酶作用于木聚糖主链生成不同链长的寡糖,是木聚糖降解酶系中最关键的酶[3],同时也是目前研究较多、应用较广泛的木聚糖降解酶。利用酶法生产的低聚木糖在动物肠道内对双歧杆菌等有高选择性增殖效果,在降低胆固醇、维持肠道健康和促进钙吸收等方面都有重要的作用[3]。另外,木聚糖酶在制浆造纸、食品、饲料添加剂及生物转化等方面都起到重要的作用[1]。

木聚糖酶在自然界分布广泛且相当丰富,国内外研究人员已从环境中筛选到产木聚糖酶的真菌[4-9]、细菌[10-11]和放线菌[2,13]。本研究从霉变的甘蔗叶中筛选到了1株链霉菌(Streptomycessp.),对该菌株进行了鉴定,并对其产酶条件及酶学性质进行了初步探讨,以期为进一步诱变筛选高活力菌株或克隆木聚糖酶基因提供微生物菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品 来自海南某地霉变甘蔗叶。

1.1.2 试剂 3,5-二硝基水杨酸、苯酚购于国药集团化学试剂有限公司；桦木木聚糖购于阿拉丁试剂公司。

0.2%木聚糖溶液:称取0.2 g木聚糖，溶解于100 mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(50 mmol/L, pH 7.0)。DNS试剂[14]:称取10 g 3,5-二硝基水杨酸,放置于500 mL去离子水中,缓慢加入10 g NaOH,50 ℃水浴溶解，依次加入200 g酒石酸钾、2 g苯酚和5 g无水Na2SO4,待全部溶解后定容至1000 mL,过滤并保存于棕色瓶中,7 d后使用。

1.1.3 培养基 筛选培养基(w/v): NaNO32 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、木聚糖 10 g、琼脂20 g、ddH2O 1 L。产酶培养基(w/v):氮源2 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、碳源5 g、ddH2O 1000 mL。

1.2 实验方法

1.2.1 木聚糖降解菌的筛选及鉴定

1.2.1.1 木聚糖降解菌的初筛 取0.5 cm×0.5 cm霉变的甘蔗叶,用无菌水清洗并收集清洗液,经稀释后涂布于筛选培养基上,30 ℃培养5～7 d,反复划线纯化培养以获得纯培养菌株。

1.2.1.2 木聚糖降解菌的复筛 将初筛获得的纯培养菌株复制到木聚糖固体平板培养基上,30 ℃培养5～7 d。用0.1%的刚果红染色30 min,用1 mol/L的NaCl脱色30 min,挑选有透明圈的菌株进行液体培养。

1.2.1.3 16S rRNA基因测序及分析 利用细菌提取试剂盒提取基因组,16S rRNA基因PCR扩增体系(50 μL)：25 μL PrimerSTAR Max DNA聚合酶(2×)、1 μL模板、引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(3′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-5′)各1 μL、22 μL ddH2O。反应程序:98 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。用PCR产物纯化试剂盒(天根)对扩增产物进行纯化后与pMD-18T载体连接,转入大肠杆菌后,37 ℃过夜培养；经酶切验证后,送往上海英俊公司进行测序。将序列提交到NCBI数据库中并用Blast软件进行序列比对,用MEGA 5.0软件采用邻接法构建系统发育进化树。

1.2.2 酶活性的测定 将筛选到的菌株进行液体培养后,离心(12000 g×5 min)收集上清液，作为粗酶液供酶活性检测。取200 μL粗酶液,加入200 μL 0.2%木聚糖,60 ℃水浴10 min；加入200 μL DNS溶液,100 ℃水浴10 min；冷却后于520 nm处测定光吸收值。粗酶液经100 ℃处理10 min后作为阴性对照；酶液样品设3个平行。

1.2.3 培养条件的优化

1.2.3.1 碳源及其浓度对酶活性的影响 分别选取果糖(Pectin)、乳糖(Lactose)、纤维素(Cellulose)、微晶纤维素(Avicel)、木糖(Xylose)和CMC-Na作为唯一碳源,在30 ℃下以120 r/min震荡培养5 d,按1.2.2中的方法测定木聚糖酶的活性。在碳源确定的基础上,碳源浓度分别设为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%,按上述方法培养及测定酶活性。

1.2.3.2 氮源对酶活性的影响 分别选取NH4Cl、尿素(Urea)、NaNO3、牛肉膏(Beef extract)、酵母提取物(Yeast extract)、蛋白胨(Peptone)和(NH4)2SO4作为唯一氮源,在30 ℃下以120 r/min震荡培养5 d,按1.2.2中的方法测木聚糖酶的活性。

1.2.3.3 初始培养pH值对酶活性的影响 分别选取6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5作为菌体培养的初始pH值,在30 ℃下以120 r/min震荡培养5 d,按1.2.2中的方法测木聚糖酶的活性。

1.2.3.4 培养温度对酶活性的影响 分别选取15、20、25、30和35 ℃作为菌体的培养温度,以120 r/min震荡培养5 d,按1.2.2中的方法测木聚糖酶的活性。

1.2.3.5 培养时间对酶活性的影响 在最佳碳源及其浓度、氮源、温度和初始pH的基础上,菌体在培养的过程中每隔24 h取样1次,共取样7次,按1.2.2中的方法测木聚糖酶的活性。

1.2.4 酶学性质的研究

1.2.4.1 酶的最适反应温度 选取最适培养条件下的粗酶液,按1.2.2中的方法,在30～70 ℃条件下测定粗酶液的木聚糖酶活性;另外,将粗酶液在30～70 ℃条件下放置1 h,然后在最适温度下检测粗酶液的温度稳定性。

1.2.4.2 酶的最适反应pH值 选取最适培养条件下的粗酶液,将反应体系的pH值分别调整至pH 4.0～6.0(100 mmol/L醋酸盐缓冲液)、pH 5.5～8.0 (100 mmol/L磷酸盐缓冲液)、pH 7.5～9.0 (100 mmol/L Tris-HCl缓冲液)、pH 8.5～10.0 (100 mmol/L glycine-NaOH缓冲液),然后在最适反应温度下按1.2.2中的方法测定粗酶液的木聚糖酶活性。

1.2.4.3 木聚糖酶酶解产物的分析 采用薄层层析法分析木聚糖酶的酶解产物,展开剂为正丁醇∶乙酸∶水(v/v/v)=2∶1∶1,显色剂为甲醇∶浓硫酸(v/v)=95∶5,烘烤显色[3]。

2 结果与分析

2.1 木聚糖降解菌的筛选及鉴定

经多次筛选平板的分离纯化,共得到10株木聚糖降解菌。根据筛选平板上水解圈的大小,选取酶活力较大的菌株ZJ-1做进一步的研究。平板培养发现其菌落特征符合链霉菌的一般特征,即菌落呈放射状,表面干燥、粗糙,与培养基结合紧密,不易挑取,表面覆盖一层干粉状的孢子。以ZJ-1菌株的基因组DNA为模板,利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增并测序，得到1条长为1347 bp的片段,并将该序列提交至GenBank,登录号为KX714289.1。根据序列比对结果并选取相关序列构建系统发育树,分析结果表明ZJ-1与Streptomycessp. WMMB 784 (登录号:KC856931.1)处于同一分支,两者的相似性为100%。此外,ZJ-1与多株链霉菌(Streptomycessp.)的相似性均在98%以上,故将该木聚糖降解菌初步鉴定为链霉菌(Streptomycessp.),命名为Streptomycessp. ZJ-1。

图1 基于16S rRNA构建的进化树

2.2Streptomycessp. ZJ-1产酶条件的优化

2.2.1 碳源及其浓度对Streptomycessp. ZJ-1产木聚糖酶的影响 在其它条件恒定的情况下,以CMC-Na为碳源时,菌株ZJ-1产木聚糖酶的活性高于其它碳源时的；果胶和微晶纤维素作碳源时次之,故将CMC-Na定为ZJ-1产酶的最佳碳源(图2A)。另外本研究发现,随着碳源CMC-Na浓度的升高,其产木聚糖酶的活性逐渐升高,当浓度达到1.0%时,木聚糖酶的活性达到最高；此后随着其浓度的进一步升高,木聚糖酶的活性逐渐降低(图2B)。

图2 不同碳源(A)及CMA-Na浓度(B)对木聚糖酶活性的影响

2.2.2 氮源对Streptomycessp. ZJ-1产木聚糖酶的影响 在其它条件恒定的情况下,以蛋白胨作为氮源时,菌株ZJ-1产木聚糖酶的活性最高(图3)；其次为NaNO3；尿素和牛肉膏作氮源时最差。这可能是因为蛋白胨作为有机氮源时营养比较丰富,使菌株在含有有机氮源的培养基中表现出生长旺盛、菌体浓度增长迅速等特点[16]。

2.2.3 初始pH值对Streptomycessp. ZJ-1产木聚糖酶活性的影响 在其它条件恒定的情况下,当培养基初始pH值低于6.0时,木聚糖酶活性极低,仅为最高酶活性的20%;当培养基初始pH升为6.5时,木聚糖酶活性升高到最高酶活性的80%;随着pH的升高,木聚糖酶的活性逐渐升高,当pH到达8.5时,木聚糖酶的活性最高;此后随着pH的进一步升高,木聚糖酶的活性逐步降低,但在pH 10.0的条件下,木聚糖酶的活性仍有最高酶活性的90%左右,这表明菌株Streptomycessp. ZJ-1在pH 6.5～10.0的范围内均可生成有活性的木聚糖酶(图4)。

2.2.4 培养温度及培养时间对Streptomycessp. ZJ-1产木聚糖酶活性的影响 温度对微生物的生长繁殖及其代谢有重要的影响,故选用合适的温度对微生物产酶具有至关重要的作用。在其它条件恒定的情况下,当Streptomycessp. ZJ-1的培养温度为25 ℃时,其产木聚糖酶的活性达到最大值;超过25 ℃时,木聚糖酶的活性迅速降低,这说明Streptomycessp. ZJ-1的最适发酵温度为25 ℃(图5A)。此外,发酵时间的长短直接影响木聚糖酶的活性。发酵时间对Streptomycessp. ZJ-1产木聚糖酶的影响如图5B所示,木聚糖酶的活性随发酵时间的延长而提高,至发酵到第6天时达到最高点,之后随着时间的延长而逐渐降低。为了减少发酵成本及降低染菌概率,选择6 d为Streptomycessp. ZJ-1的最佳发酵时间。

图3 不同氮源对木聚糖酶活性的影响

图4 初始培养pH值对木聚糖酶活性的影响

2.3 木聚糖酶的酶学性质初步分析

2.3.1 pH值对酶活性的影响 将获得的粗酶液在pH 4.5～10.0条件下测木聚糖酶的活性,结果如图6所示。由图6可见,当pH低于6.0时,随着pH的升高,木聚糖酶的活性逐步升高;当pH超过6.0时,随着pH的升高,酶活性逐渐降低；当pH值为10.0时酶活性达到最低值,仅为最高酶活性的10%。故Streptomycessp. ZJ-1产木聚糖酶的最适反应pH值为6.0。

图5 培养温度(A)及培养时间(B)对木聚糖酶活性的影响

图6 pH值对木聚糖酶活性的影响

2.3.2 温度对酶活性的影响 获得的木聚糖酶粗酶液在30～70 ℃条件下的活性如图7A所示。从图7A可以看出：当温度低于60 ℃时,随着温度的升高,木聚糖酶的活性逐步升高;当温度超过60 ℃时,酶活性有所降低,但仍保有最高时90%的相对酶活性。故Streptomycessp. ZJ-1产木聚糖酶的最适反应温度为60 ℃。另外,将木聚糖酶在35～70 ℃条件下放置1 h,然后测木聚糖酶的活性,结果图7B所示,在低于55 ℃条件下,该酶能保持很好的稳定性；当温度升高到60 ℃时,丧失30%左右的酶活性;当温度升高到70 ℃时,酶活性基本丧失,仅为原来的10%。

2.3.3 木聚糖酶酶解产物分析 以桦木木聚糖为底物的水解产物,经薄层层析色谱图分析均可观察到木二糖、木三糖、木四糖及木五糖,但还有一些聚合度大于5的多糖(图8)。

3 讨论与小结

半纤维素是农作物秸秆的重要组成部分,是世界上丰富的可再生有机资源。但由于其结构复杂,用常规的方法难以将其充分降解,现在一般采用物理化学等预处理方法结合高效半纤维素降解菌来快速降解半纤维素。本实验通过木聚糖固体培养基分离筛选,结合透明圈的大小,从腐败的甘蔗叶表面筛选到10株半纤维素降解菌,经过对这10株菌株进行木聚糖酶活性检测,最终选择到1株具有高酶活性的菌株ZJ-1；经16S rRNA序列同源性分析,菌株ZJ-1与Streptomycessp. WMMB 784的相似性为100%,初步确定该菌株属于链霉菌(Streptomycessp.)。

图7 温度对木聚糖酶活性(A)及稳定性(B)的影响

图8 TLC分析木聚糖酶的水解产物

本研究筛选到的菌株Streptomycessp. ZJ-1具有较好的产木聚糖酶的能力,该菌在以CMC-Na为碳源,蛋白胨为氮源,初始培养pH 6.5～10.0,培养温度为25 ℃的条件下,连续培养6 d,其产木聚糖酶的活性达40.0 U/mL。酶学性质初步研究结果表明, ZJ-1所产木聚糖酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH为6.0；其酶解产物包括木二糖、木三糖、木四糖及木五糖。以上实验结果为该菌株与其它菌株组成混合菌群进行甘蔗叶的降解奠定了基础。

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(责任编辑:黄荣华)

Identification of A Xylanase-producing Bacterial Strain,Optimization of Its Xylanase-producing Conditions,and Properties of Produced Xylanase

YAO Jian, CHEN Qing-long, ZHANG Cheng, ZHONG Guo-xiang, WANG Hong-xiu, MA Ji-ping

(Institute of Agricultural Applied Microbiology, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China)

A novel bacterial strain ZJ-1 producing xylanase was isolated from the decomposed sugarcane leaves by using the methods of xylanase-hydrolyzing ring and extracellular enzymatic activity determination. The Blast of the 16S rRNA fragment in GenBank and the phylogenetic tree analysis indicated that the homology of ZJ-1 withStreptomycessp. (accession number: KC856931.1) was more than 98%. Therefore, ZJ-1 was identified asStreptomycessp. ZJ-1. Under the optimum xylanase-producing conditions (using CMC-Na as carbon source, using peptone as nitrogen source, pH 6.5～10.0 for initial culture, culture for 6 days at 25 ℃), the activity of xylanase produced by ZJ-1 reached 40.0 U/mL. The optimum reaction temperature and reaction pH-value for the produced xylanase were 60 ℃ and 6.0, respectively.

Xylanase;Streptomycessp.; Identification of bacterial strain; Optimization of xylanase-producing condition; Enzymatic property

2016-10-08

江西省青年科学基金项目(20142BAB214010);科技部国际科技合作项目“农村有机废弃物资源化利用技术合作研究” (2012DFA91160);公益性行业(农业)科研专项(201103007、201203072、201303080)。

姚健(1982─),女,山东潍坊人,助理研究员,博士,主要从事微生物及微生物基因资源筛选研究。

Q559

A

1001-8581(2017)02-0090-05