2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA及NS基因进化分析

张如胜，孙边成，姚 栋，叶 文，陈静芳，黄 政，刘晓蕾，欧新华，陈发明

2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA及NS基因进化分析

张如胜，孙边成，姚 栋，叶 文，陈静芳，黄 政，刘晓蕾，欧新华，陈发明

目的 分析2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)血凝素(Hemagglutinin, HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)及非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进化特征。方法 从2014年长沙市活禽市场采集501份环境标本，利用Real-time PCR方法进行A型、H5、H7和H9亚型流感病毒核酸检测，并对单一H5阳性标本进行核苷酸测序，病毒HA、NA和NS基因测序结果进行在线BLAST分析，利用Mega5和Bioedit软件构建核苷酸进化树和氨基酸(Amino acids，aa)比对。结果 从501份环境标本中检出A型H5亚型病毒阳性标本177份(检出率35.33%)，其中8份标本经核苷酸测序鉴定为H5N1亚型病毒，进化分析表明大部分H5N1病毒HA基因位于2.3.2分支内，聚集形成一个新亚分支，NA及NS基因位于2.3.2.1b亚分支。HA蛋白受体结合位点aa为QSG, 表现为禽流感病毒受体特征；NA蛋白未出现H275Y及N295S aa替换，对神经氨酸酶抑制剂敏感；HA、NA及NS蛋白关键分子位点表现为高致病性的分子特征。结论 2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒 HA、NA和NS基因表现为高致病性的分子特征，但不具有对人易感的受体特征，需要进一步监测。

活禽市场；环境；禽流感病毒；H5N1亚型；基因；进化

根据流感病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)抗原性的不同，A型流感病毒可分为18个HA亚型(H1-H18)和11个NA亚型(N1-N11)[1]。根据禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)对禽致病性的不同，可以分为低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza,LPAI)和高致病性禽流感(high pathogenic avian influenza,HPAI)病毒[2]。在这些亚型中，仅仅只有引起禽类高死亡率的H5和H7亚型被认为是HPAI病毒[2]。

研究[3]显示长沙市活禽市场环境中H5N1病毒核酸阳性率较高，存在传播AIV的风险。为此，本研究对2014年长沙市活禽市场环境中的H5N1病毒 HA、NA及NS基因进行测序，分析其致病性、受体及耐药等分子特征。

1 材料与方法

1.1 活禽市场环境标本H5亚型AIV核酸检测 按照《职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案(2011年版)》，采集2014年长沙市辖区活禽市场环境标本501份(禽类污水221份、禽类饮水263份、其他标本17份)，利用Real-time RT-PCR方法进行A型及H5、H7、H9亚型流感病毒核酸检测，检测用Real-time RT-PCR引物和探针序列来源于中国国家流感中心，引物及探针由上海invitrogen公司合成。

1.2 HPAI H5N1病毒HA、NA及NS基因扩增及核苷酸序列测定 将在2014年长沙市活禽市场环境中监测到的50份H5亚型AIV阳性污水标本(排除H7和H9亚型AIV核酸阳性)利用Rneasy○RMini Kit (德国QIAGEN 公司)进行RNA核酸提取，然后利用SuperScript○RIII One-Step RT-PCR System with Platinum○RTaq RT-PCR(Life Technologies 公司)、HA和NA基因通用扩增引物[4]对HA和NA基因片段分别进行RT-PCR扩增，扩增反应条件参考文献[5]。RT-PCR扩增后的预期目的片段TA克隆测序由上海Life Technologies 公司完成。

1.3 污水中HPAI H5N1病毒 HA、NA及NS基因进化分析 长沙市活禽市场污水中HPAI H5N1病毒HA、NA及NS基因测序结果利用BioEdit软件拼接后提交至Genbank，利用在线基本局部相似性搜索工具(Basic local alignment search tool, BLAST)进行相似性分析(http：//BLAST.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi)。从流感病毒资源库(Influenza Virus Resource，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph-select.cgi)下载长沙市活禽市场污水中HPAI H5N1病毒、国内部分HPAI H5N1病毒及A/barn swallow/Hong Kong/1161/2010(HK/1161-like)、A/Hubei/1/2010(Hubei/1-like)、A/Hong Kong/6841/2010(HK/6841-like)和A/chicken/Cambodia/TLC1/2009(TLC1/2009-like)等谱系代表株HA、NA及NS基因片段核苷酸序列，利用BioEdit、MEGA 5软件的Neighbor-joining方法和Tamura-Nei 模式构建进化树。

1.4 污水中HPAI H5N1病毒 HA、NA及NS基因关键位点分析 选择并从流感病毒资源库中下载人感染HPAI H5N1病毒参考株A/Hunan/1/2009、A/Hubei/1/2010、HK/1161-like、A/duck/Hunan/S4150/2011和A/Goose/Guangdong/1/96病毒HA、NA及NS基因片段编码aa序列，利用BioEdit软件将上述病毒和本研究中的污水HPAI H5N1病毒aa序列进行多重比对、分析各基因关键位点分子特征。

2 结 果

2.1 活禽市场污水标本AIV核酸监测结果 对2014年长沙市活禽市场污水中采集到的501份标本进行AIV核酸检测，共检出A型AIV核酸阳性标本350份，其中H5亚型核酸阳性标本177份，占35.33%，H9亚型核酸阳性标本191份，H7亚型核酸阳性标本11份，H5和H9混合阳性标本68份，H5和H7混合阳性标本6份，H7和H9混合阳性标本3份，H5、H7和H9混合阳性标本1份，未分亚型阳性标本28份。

2.2 活禽市场污水标本HPAI H5N1病毒核苷酸序列测定结果 50份H5亚型核酸阳性标本经TA克隆核苷酸序列测定，成功获得23条基因序列，其中HA和NA基因序列均为8条,NS序列为7条，各基因序列已上传至GenBank(登录号为：KX247915-KX247937)。BLAST比对分析表明：8条HA基因序列分别与来源于越南和中国云南的禽HPAI H5N1病毒分离株HA基因高度相似(97.05%～99.36%)；8条NA基因序列分别与来源于中国山东、甘肃和越南禽HPAI H5N1病毒分离株NA基因高度相似(95.36%～99.78%)；7条NS 基因序列分别与中国江西和越南禽来源HPAI H5N1病毒分离株NS基因高度相似(99.07%～99.77%)；HA和NA基因BLAST结果表明上述8份污水标本中存在的病毒为HPAI H5N1病毒。

2.3 HPAI H5N1病毒进化树构建 将本研究中的8株HPAI H5N1病毒和近年来分离自中国及越南的部分HPAI H5N1病毒分离株 HA、NA和NS基因构建进化树，HA基因进化树形成2.3.2及2.3.4两个进化分支，其中2.3.2又进化形成2.3.2.1a、2.3.2.1b和2.3.2.1c亚分支，2.3.4又形成2.3.4.1、2.3.4.2和2.3.4.4亚分支，本研究中的CS/156病毒属于2.3.4.4亚分支，而本研究中的另外7株HPAI H5N1病毒(CS/14, CS/15, CS/42, CS/115, CS/116, CS/155, CS/213)位于2.3.2分支内，但不属于2.3.2.1a、2.3.2.1b和2.3.2.1c任何1个亚分支，和分离自越南和中国江苏的禽源HPAI H5N1病毒亲缘关系近，共同聚集形成一个亚分支。

NA基因进化树形成HK/1161-like、Hubei/1-like、HK/6841-like和TLC1/2009-like谱系分支，其中本研究中的7株H5N1亚型病毒(CS/14, CS/15, CS/115, CS/116, CS/155, CS/156, CS/213)与分离自越南和中国内地的禽源HPAI H5N1病毒分离株进化距离近，共同聚集一个分支，来源于HK/1161-like病毒(2.3.2.1b亚分支)，另外1株H5N1亚型病毒 (CS/42)单独形成1个亚分支，与HK/6841-like病毒(2.3.2.1c亚分支)进化距离近。

NS基因进化树与NA基因类似，同样形成了HK/1161-like、Hubei/1-like、HK/6841-like和TLC1/2009-like谱系分支，本研究中的6株H5N1亚型AIV(CS/14, CS/15, CS/42, CS/116, CS/156, CS/213)与HK/1161-like病毒来源相似(2.3.2.1b分支)，另外1株H5N1亚型病毒 (CS/115) 与A/wild duck/Shandong/1/2011(H5N1)聚集形成1个亚分支，与TLC1/2009-like(1.1.1分支)进化距离近。

2.4 HPAI H5N1病毒HA、NA及NS基因关键位点分析 本研究中的8株H5N1亚型病毒 HA基因HA1和HA2 蛋白连接肽(323-331 位点)出现多个碱性aa(RERRR-KRG或RERRG-KRG，其中R，K为碱性aa)，与其他HPAI H5N1病毒参考株HA基因致病特征相似，对禽表现为高致病性特征，与LPAI H9N2 病毒具有1个碱性aa的低致病性分子特征不同，见表1。本研究中的8株H5N1亚型病毒HA 蛋白RBS第222～224 位(对应H3 型流感病毒编码aa第226-228位)aa为QSG或 QRG，表明其受体为禽源流感病毒特异性受体[6]，与人源或禽源HPAI H5N1病毒参考株 HA基因特征相似，具有不容易感染人的受体特征，见表1。

本研究中的8株HPAI H5N1病毒 NA蛋白均缺失20个aa，不同于HPAI H5N1病毒参考株A/Goose/Guangdong/1/96，但其第116、117、119、150、223、 247、275、295位编码aa与A/Goose/Guangdong/1/96代表株相似，未发生H275Y及N295S aa替换，见表1。

相比HPAI H5N1病毒参考株A/Goose/Guangdong/1/96的第42、92和149位aa分别为A、D和A, 本研究中的7株HPAI H5N1病毒分别为 S、E和A，出现D92E aa突变位点，另外与A/Goose/Guangdong/1/96不同的是，7株HPAI H5N1病毒第80-84位aa均出现缺失，表1中包括本研究7株病毒在内的全部HPAI H5N1病毒C-末端均为ESEV，见表1。

3 讨 论

人感染H7N9、H10N8、H5N6、H5N1等[7-9]亚型AIV疫情流行病学调查已证实禽类场所为人感染AIV的重要来源。本研究显示2014年长沙市活禽市场环境中H5亚型AIV核酸阳性率高达35.33%，与2009年长沙市活禽市场环境环境中H5亚型AIV核酸阳性率(31.30%)相似[3]，表明长沙市活禽市场环境中H5亚型AIV仍然广泛存在。

HA进化分析显示本研究中的 HPAI H5N1病毒与分离自越南和中国江苏的禽源HPAI H5N1病毒共同聚集形成了一个新的亚分支；NA及NS进化分析显示本研究中的HPAI H5N1病毒NA及NS分别来源于2.3.2.1b、2.3.2.1c和1.1.1分支；表明2014年长沙市活禽市场环境中HPAI H5N1病毒基因进化和来源的多样性。

流感病毒致病性与HA蛋白连接肽位点碱性aa数目的多少密切相关[6]，本研究中的8株H5N1亚型病毒 HA 蛋白连接肽位点出现多个碱性aa，为HPAI 病毒，其中7株AIV NS1蛋白出现了D92E aa突变位点，具有增强AIV在宿主中的毒力作用[10-11]，且NS1蛋白C-末端为ESEV序列，进一

表1 长沙市HPAI H5N1病毒与参考株病毒HA、NA及NS1蛋白关键位点特征分析
Tab.1 Analysis of the important amino acids of the HA, NA and NS1 proteins of HPAI H5N1 strains from Changsha city with reference strains. Substitutions of particular concern are shown in bold.

VirusHANANS1Cleavagesite323-331RBS222-224Stalkregion1161171191502232472752954292150C-terminalCS/14RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/15RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/42RERRG-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/115RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/116RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/156RERRR-KRGQRG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/213RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVCS/155RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHN无无无无Hunan/1RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVHubei/1RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVHK/1161IERRRRKRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVHunan/S4150RERRR-KRGQSG20aadeletionVIEKISHNSEAESEVGD/1IERRRKKRGQSGNodeletionVIEKISHNADAESEV

* Hunan/1:A/Hunan/1/2009; Hubei/1:A/Hubei/1/2010; HK/1161:A/barn swallow/Hong Kong/1161/2010; Hunan/S4150:A/duck/Hunan/S4150/2011; GD/1:A/Goose/Guangdong/1/96.

步证实这些病毒具有高致病性的分子特征[11]。本研究中的8株HPAI H5N1病毒HA蛋白RBS区域基因特征表现为与禽细胞表面受体(SA-2,3-Gal)亲和[12]，不容易感染人类，但是由于人感染HPAI H5N1 病毒病例大多数表现为重症，死亡率高达53%[13]，因此需要进一步加强活禽市场环境中H5N1病毒监测。本研究中的HPAI H5N1病毒NA基因特征显示神经氨酸酶抑制剂治疗仍然有效[14-15]。

目前，国内外不断新增人感染HPAI H5N1 病毒病例报告，且在禽类市场活禽销售模式未改变、活禽市场污水中H5N1亚型病毒污染状况未减轻的情况下，需要密切监测活禽市场环境中H5N1亚型病毒进化状况，及时评估、预警HPAI H5N1 病毒的潜在传播风险。

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Evolution of the HA，NA and NS genes of H5N1 avian influenza viruses from sewage in live bird markets in Changsha, 2014

ZHANG Ru-sheng, SUN Bian-cheng, YAO Dong, YE Wen, CHEN Jing-fang, HUNG Zheng, LIU Xiao-lei,OU Xin-hua, CHEN Fa-ming

(ChangshaCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha410004,China)

The aim of this study is to analyze the evolutional and molecular characteristics of Hemagglutinin (HA), Neuraminidase(NA)and non-structural (NS) genes of H5N1 avian influenza virus (AIV) from sewage in live bird markets (LBMs) in Changsha, 2014. Five hundred and one specimens were collected from environment in LBMs in Changsha, 2014,and real-time RT-PCR was used for influenza A typing and subtyping (H5,H7 and H9) detection. Sequencing were used for the positive of single H5. The sequence homology of HA,NA and NS genes of the viruses were analyzed with the online Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). The phylogenetic trees for HA,NA and NS genes and the ClustalW Multiple alignments of amino acids were constructed using MEGA 5 and BioEdit software, respectively. Results showed that of 501 environmental samples, 177 (35.33%) samples were positive for influenza A viruses and H5 subtype. Eight H5N1 subtype AIV were confirmed by sequencing from the samples of the positive of single H5. Phylogenetic analysis indicated that most of HA genes of the H5N1 subtype AIV strains isolated in Changsha city were located in 2.3.2 and clustered into new subclade, and the most of NA and NS genes in this study were clustered into subclade 2.3.2.1b. QSG of the HA protein of the receptor binding site were found in these H5N1 viruses, and the characteristics was shown to be associated with increased affinity of HA to the glycan-receptors of AIV. In strains from this study, we did not found amino acid substitutions of the NA protein at H275Y and N295S, and sensitive to neuraminidases, and the high pathogenicity molecular characteristics of HA, NA and NS genes were showed in these viruses. In conclusion, molecular characteristics of the HA, NA and NS of these H5N1 subtype viruses in this study showed high pathogenicity, but that may not facilitate human infection. So, the prevalence and genetic evolution of this virus should be closely monitored.

live bird market; environment; avian influenza virus; H5N1 subtype; gene; evolution

Chen Fa-ming, Email: 351985738@qq.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.016

陈发明，Email: 351985738@qq.com

长沙市疾病预防控制中心，长沙 410004

R373.1

B

1002-2694(2017)01-0085-04

2016-05-24 编辑：李友松

湖南省卫生计生委2015年度科研计划项目(B2015-153)