云南省非O1/ O139群霍乱弧菌分子特征分析

廖 凤，古文鹏，徐 闻，伏晓庆

云南省非O1/ O139群霍乱弧菌分子特征分析

廖 凤1，古文鹏2，徐 闻2，伏晓庆2

目的 非O1/O139群霍乱弧菌能够引起人类急性腹泻性疾病，但与O1群和O139群相比，人们往往容易忽视其危害性。因此，我们对分离于云南省的31株非O1/O139群霍乱弧菌开展了分子特征分析。方法 采用纸片法(K-B)开展抗生素敏感试验；多聚酶链反应(PCR)扩增检测毒力基因；同时，我们对菌株进行了脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分析(MLST)分子分型研究。结果 药敏实验结果显示，67.74%的菌株对利福平耐药，对萘啶酸和复方新诺明的耐药率为29.03%，所有的菌株对庆大霉素和环丙沙星敏感；PCR结果显示，所有菌株的ompW基因为阳性，87.10%的菌株hly基因为阳性，25.81%的菌株rstREl tor为阳性，16.13%的菌株rstRClassical和tcpAEl tor为阳性，而CT、rfbO1和rfbO139基因全为阴性；PFGE结果显示，31株非O1/O139群霍乱弧菌呈现出高度的离散趋势，几乎没有相同带型的菌株出现；在MLST结果分析中，发现了1个gyrB新的等位基因，mdh基因发现了4个新的等位基因，metE基因发现了6个新的等位基因，pntA中发现了2个新的等位基因，purM中发现了3个新等位基因，pyrC中发现了4个新等位基因。经过排列组合后，共发现了17个新的霍乱弧菌ST型别(ST273-ST289)。结论 非O1/O139群霍乱弧菌呈现出高度的多样性特征，同时，云南省的非O1/O139群霍乱弧菌具有一定的地域特点，丰富了现有的霍乱弧菌分子分型数据库。

非O1/O139群霍乱弧菌；脉冲场凝胶电泳；多位点序列分析

云南省地处祖国的西南边陲，与缅甸、越南等国家接壤，具有较长的边境线，是我国西南地区重要的桥头堡。各国之间人员流动来往频繁，加之特殊的亚热带气候，使之成为传染病高发地区之一。自1986年至今，云南省的霍乱疫情时有发生，特别是近年来以输入性和散发性病例为主要特征[1]。

非O1/O139群霍乱弧菌是指除了O1和O139群霍乱弧菌以外的其他血清群的霍乱弧菌[2-3]。非O1/O139群霍乱弧菌广泛存在于外环境中，能够引起人类急性腹泻，其临床表现为轻症胃肠炎或是腹泻。到目前为止，在一些经济及卫生条件比较落后的地方，几乎每年都有非O1/O139群霍乱弧菌散发和局部暴发的报道[4]。部分地区，非O1/O139群霍乱弧菌的发病率已远高于O1和O139群[5]。而云南省因地处祖国的内陆区域，加上人们的饮食习惯与沿海地区有较大差异，所以通过监测分离得到的非O1/O139群霍乱弧菌较少。然而对于此类菌株的分析和研究工作又格外重要。因此，我们对既往从云南省分离得到的31株非O1/O139群霍乱弧菌开展了菌株的分子特征分析。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 31株非O1/O139群霍乱弧菌来源于自1986年至2016年间通过霍乱监测分离得到的菌株，其中12株分离于1986年、1株分离于1989年、1株分离于1991年、1995年2株、1996年2株、1998年8株，2001年4株和2016年1株。从病人身上分离得到的菌株为5株、水中分离得到为9株，其余均为从外环境分离得到。

1.2 药敏试验 采用K-B药敏纸片法进行抗生素药敏试验，药敏试验结果判定根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的微生物敏感试验执行。采用ATCC25922大肠埃希氏菌为质控菌株，选取10种抗生素作为研究对象。分别为：氨苄西林(AMP)，阿莫西林/克拉维酸(AMC)，头孢噻吩(CFT)，头孢噻肟(CTX)，GEN(庆大霉素)，萘啶酸(NAL)，环丙沙星(CIP)，四环素(TET)，利福平(RFA)和磺胺甲基异恶唑/甲氧苄啶(SMZ)。

1.3 PCR检测毒力基因 采用细菌基因组提取试剂盒(Tiangen, Beijing)提取霍乱菌株的核酸，按照说明书的操作程序进行。扩增O1群和O139血清型菌株的rfb基因和霍乱弧菌属ompW基因，给予菌株的确认。采用SYBR premix(TaKaRa, Japan)预混液进行扩增，程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，循环40次，在退火阶段检测荧光。扩增毒力基因ctxAB(CT)、hly、rstR(Classical/Eltor)、tcpA(Classical/Eltor)，按照参考文献的方法进行检测[1]，引物序列及扩增程序见参考文献[1]，扩增采用Taq premix预混液(TaKaRa, Japan)进行扩增。

1.4 PFGE 按照PulseNet公布的霍乱弧菌PFGE标准操作过程进行试验，并参考相关文献进行[1]。采用CHEF-Mapper电泳仪(Bio-Rad)进行电泳，参数设置为1～20 s，13 h；20～25 s，6 h。每块胶的酶的用量为NotI 40 U，酶切温度为37 ℃，酶切4 h。采用Gelred核酸染料进行染色，采用凝胶成像仪(Bio-Rad, Gel DocXR)读取图像结果。采用BioNumberics V5.10软件对结果进行聚类分析，应用非加权组平均法(UPGMA)，聚类相似性系数(距离)采用基于条带比较的Dice。

1.5 MLST 按照http://pubmlst.org/vcholerae公布的霍乱弧菌adk,gyrB,metE,mdh,pntA,purM和pyrC管家基因合成引物，采用Taq premix进行PCR扩增。扩增产物送昆明硕擎公司进行序列测定。DNA序列结果采用DNAStar软件进行拼接，MEGA4.0软件进行结果的比较，同时在数据库中寻找每个基因对应的等位基因号。如果出现新的等位基因序列，则将序列提交给数据库进行确认，由数据库给予新的等位基因号和ST型别。

2 结 果

2.1 药敏试验结果 药敏实验结果显示，67.74%的菌株对利福平耐药，对萘啶酸和复方新诺明的耐药率为29.03%，5株从病人中分离得到的菌株对氨苄西林和阿莫西林耐药；所有的菌株对庆大霉素和环丙沙星敏感，见表1。

2.2 PCR结果 所有菌株的霍乱弧菌属ompW基因为阳性，rfbO1和rfbO139基因全为阴性，因此确认所有菌株均为非O1/O139群霍乱弧菌。在31个菌株中，87.10%的菌株hly基因为阳性，25.81%的菌株rstREl tor为阳性，16.13%的菌株rstRClassical和tcpAEl tor为阳性，霍乱弧菌肠毒素(ctxAB)基因均为阴性。

2.3 PFGE结果 31株非O1/O139群霍乱弧菌呈现出高度的多态性带型分布特点，几乎没有相同的带型菌株出现，见图1所示。带型分布与菌株的分离时间、来源等无关联。

表1 云南省非O1/O139群霍乱弧菌药敏试验结果
Tab.1 Antibiotics resistant results of non O1/O139V.choleraein Yunnan Province

AntibioticsSensitive/NumberPercent(%)Medium/NumberPercent(%)Resistant/NumberPercent(%)AMP2683.8700.00516.13AMC2683.8700.00516.13CFT3096.7700.0013.23CTX3096.7700.0013.23GEN3110000.0000.00NAL2270.9700.00929.03CIP3110000.0000.00TBT2683.87412.9013.23RFA1032.2600.002167.74SMZ2270.9700.00929.03

图1 云南省31株非O1/O139群霍乱弧菌PFGE聚类图Fig.1 PFGE results of 31 non-O1/O139 V. cholerae in Yunnan Province

2.4 MLST结果 在MLST结果分析中，我们发现了1个gyrB的新等位基因(87)，mdh基因发现了4个新的等位基因(78-81)，metE基因发现了6个新的等位基因(161-165)，pntA中发现了2个新的等位基因(94，95)，purM中发现了3个新等位基因(66-68)，pyrC中发现了4个新等位基因(123-126)。所有基因新发现的等位基因均由MLST公共数据库进行确认，并将序列提交到数据库当中。经过7个管家基因的排列组合后，我们新发现了17个新的霍乱弧菌ST型别，被命名为ST273-ST289。所有菌株的MLST最小生成树见图2所示，除了ST8、ST85和ST87之外，其余所有ST型别均为本次研究首次发现。

图2 云南省31株非O1/O139群霍乱弧菌MST图Fig.2 MLST results of 31 non-O1/O139 V. cholerae in Yunnan Province

3 讨 论

非O1/O139群霍乱弧菌是指除O1群和O139群霍乱弧菌以外的其他霍乱弧菌的总称。通常O1群和O139群霍乱弧菌致病菌株携带ctxAB、toxR、tcpA以及致病性毒力岛等毒力基因，其中以ctxAB霍乱肠毒素为主要致病因素[6]。研究中，从云南省分离得到的所有31株非O1/O139霍乱弧菌的ctxAB基因均为阴性，不携带霍乱肠毒素，但有5株是分离于病人中的菌株，表明传统认为的非致病性菌株也能引起人类的腹泻性疾病。在31个菌株中，87.10%的菌株hly基因为阳性，而且部分菌株具有tcpA毒力基因，所以在霍乱监测体系中，非O1/O139群霍乱弧菌是一类不容忽视的重要病原体。

既往的研究结果显示，非O1/O139群霍乱弧菌是一类高度多态性的菌株[7]。以PFGE为主要分型方法的报道显示，这些菌株带型分布广泛，无论是环境分离株还是从病人中分离的菌株带型呈现高度的多态性特征[8-9]。本次研究中也能反映出上述研究结论，在PFGE分型结果中，即使菌株分离于同一年份或是来源途径相同，也几乎没有相同带型的菌株出现。另一方面，从MLST分型结果中我们发现除了adk基因之外，其余所有的6个管家基因都有新的等位基因出现。我们将所有新发现等位基因序列提交数据库，并得到了数据库的确认和新等位基因的命名，其中以metE基因发现的新等位基因个数最多，gyrB的等位基因新发现数最少，通过排列组合后，新发现了17个新的霍乱弧菌ST型别。由此可以看出，云南省非O1/O139霍乱弧菌具有自身的地域特点。研究组还对71株云南省分离的O1/O139群霍乱弧菌开展了同样的MLST分型研究，结果却显示所有菌株均为ST69型，这与非O1/O139菌株形成了鲜明的对比，分型结果提示致病性的O1/O139群霍乱弧菌在进化过程中形成了较少的克隆群，与人类的霍乱发生密切相关，而非O1/O139群则呈现高度的多态性。同时MLST分型结果也提示目前基于7个管家基因的多位点序列分析对于非O1/O139群菌株可能更加适用。

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Molecular characteristics of non-O1/O139Vibriocholeraein Yunnan Province

LIAO Feng1, GU Wen-peng2, XU Wen2, FU Xiao-qing2

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstPeople'sHospitalofYunnanProvince,Kunming650022,China;2.YunnanProvincialCentersforDiseasesControlandPrevention,Kunming650022,China)

Non-O1/O139 group ofVibriocholeraecan cause human acute diarrhea disease, while compared with the O1 and O139 groups; it often ignore the risk of the disease for human being. Therefore, we analyzed the molecular characteristics of 31V.choleraeisolated from Yunnan Province. We used the agar disc diffusion method (K-B) to carry out the antibiotic sensitivity test; polymerase chain reaction (PCR) amplification for the detection of virulence gene; at the same time, all of strains were performed for pulse field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). The drug sensitivity test showed that 67.74% strains were resistant to rifampin, 29.03% resistant to nalidixic acid and cotrimoxazole, all of the isolates were sensitive to gentamicin and ciprofloxacin; PCR results showed that all strains had theompWgene, 87.10% strains hadhlygene, 25.81% strains hadrstREl tor, 16.13% strains hadrstRClassicalandtcpAEl tor, whileCTrfbO1andrfbO139gene were negative; PFGE results showed that 31 strains had a trend of discrete height, the same PFGE identity pattern was not nearly found; for the analysis of MLST, we found the one new alleles ofgyrB, four new alleles ofmdhgene, six new alleles ofmetEgene, two new alleles ofpntA, three new alleles ofpurMand four new alleles ofpyrCgene. After permutation and combination, we found 17 new ST types forV.cholerae(ST273-ST289). Non-O1/O139 groupV.choleraeshowed a high degree of diversity, while the non-O1/O139 group ofV.choleraein Yunnan Province has a certain geographical features, which enriched the existing molecular typing system ofV.cholerae.

non-O1/O139Vibrocholerae; pulsed field gel electrophoresis; multi locus sequence typing

Fu Xiao-qing, Email: yncdcfxq@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.010

国家科技重大专项(No.2012ZX10004212)资助

伏晓庆，Email: yncdcfxq@163.com

1.云南省第一人民医院呼吸内科，昆明 650022； 2.云南省疾病预防控制中心，急性传染病防制所，昆明 650022

R378.3

A

1002-2694(2017)01-0053-04

2016-07-20 编辑：梁小洁

Supported by the National Sci-Tech Key Project (No.2012ZX10004-212)