大肠癌组织MAL mRNA、蛋白表达及其启动子甲基化状态研究

2017-02-17吴小昌童国俊谢平

浙江医学 2017年2期

吴小昌童国俊谢平

吴小昌童国俊谢平

目的探讨MAL基因对大肠癌筛查及早期诊断的价值。方法选取10例正常大肠组织作为对照，应用RT-PCR、甲基化特异性PCR、Western blot方法分别检测并比较大肠癌组织（40例）及相应癌旁组织（40例）中MAL mRNA、蛋白的表达情况以及MAL基因启动子甲基化状态。结果大肠癌组织中MAL mRNA、蛋白的表达阳性率（10.0%、20.0%）均低于其在癌旁组织（75.0%、85.0%）和正常大肠组织（100.0%、100.0%）中的表达阳性率（均P＜0.05），而大肠癌组织中MAL基因启动子甲基化率（90.0%）均高于其在癌旁组织（40.0%）和正常大肠组织（0.0%）中的甲基化率（均P＜0.05）。结论大肠癌组织中MAL基因或可作为大肠癌筛查及早期诊断的高潜力分子标志物。

大肠癌 MAL基因抑癌基因 DNA甲基化

大肠癌是临床常见的恶性肿瘤，早期诊断对其预后影响重大。目前，分子生物学检测是研究大肠癌筛查及早期诊断的热点[1]。研究表明MAL基因表达缺失和人类多种恶性肿瘤的发生、发展相关，在乳腺癌、肾癌、卵巢癌、口腔癌及子宫内膜癌等多种肿瘤组织中都检测到MAL基因启动子呈高度甲基化状态[2]。本研究应用RTPCR、甲基化特异性PCR（MSP）、Western blot方法检测大肠癌组织、其癌旁组织及正常大肠组织中MAL mRNA、蛋白的表达情况以及MAL基因启动子甲基化状态，探讨MAL基因在大肠癌发生、发展过程中可能所起的作用，以期为大肠癌筛查和早期诊断的研究提供新思路，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料大肠癌组织（40例）、癌旁组织（40例），正常成人大肠组织（10例）皆取自本院外科住院患者。其中大肠癌组织、癌旁组织取自大肠癌手术切除的标本，癌旁组织为对应的距癌肿10cm以上结肠组织；正常成人大肠组织来自行吻合器痔环切术切除的标本。所有患者术前均未接受放、化疗及其他抗癌治疗，标本切除后立即于-80℃冰冻保存用于下一步实验。本研究经医院医学伦理委员会批准，并经患者及家属知情同意。

1.2 试剂和仪器 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司, DNA抽提试剂盒购自天根公司，DNATaq聚合酶、TEMED、DNA纯化回收系统（A7280）购自美国Promega公司，逆转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司，1∶100兔抗人MAL多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物科技有限公司，1∶100兔抗人β-actin多克隆抗体购自北京博奥森生物技术公司，HRP标记的羊抗兔二抗购自北京中衫金桥生物技术公司，蛋白抽提试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司，基因甲基化一步法检测试剂购自美国Genmed公司。主要仪器为德国Eppendorf公司PCR扩增仪、美国BIO-RAD公司半干式转移电泳装置及电泳仪等。

1.3 MAL基因引物序列及扩增条件 RT-PCR：正向引物序列5′-AAGATCCTCTGCTGACCCCT-3′，反向引物序列5′-ACCATGGACCTCTGGAAAGA-3′，扩增片段166bp。β-actin基因：正向引物序列5′-ACGTTGCTATCCAGGCTGTG-3′，反向引物序列5′-AATGTCACGCACGATCGATTCC-3′，扩增片段239bp，在实验中用作内参照。MSP：Methylated（甲基化）正向引物序列5′-TTCGGGTTTTTTTGTTTTTATTC-3′，反向引物序列5′-GAAAACCATAACGACGTACTAACGT-3′，扩增片段139bp。Unmethylated（未甲基化）正向引物序列5′-TTTTGGGTTTTTTTGTTTTTAATTT-3′，反向引物序列5′-ACAAAAACCATAACAACATACTAACATC-3′，扩增片段142 bp。引物由上海申能博彩生物工程技术公司合成。RT-PCR循环参数：94℃预变性5min，（94℃30s，56℃30s，72℃30s）共35循环，72℃延伸7min；MSP循环参数:94℃预变性 5min，（94℃ 30s，56℃ 30s，72℃30s）共35循环,72℃延伸7min。

1.4 实验方法（1）RT-PCR：采用Trizol法抽提组织mRNA，实验步骤严格按照试剂说明书进行。紫外分光光度计检测mRNA的浓度和纯度，A260/A280在1.8～2.0间的mRNA入选进行反转录。以两步法行RT-PCR。取PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像仪扫描、拍照，用软件分析各条带灰度值，以目的基因与内参β-actin灰度值比值表示其相对含量（MAL扩增片段166bp，β-actin扩增片段239bp，若灰度值比值≥1则视为MAL mRNA表达阳性）。（2）Western blot：从各种组织中提取总蛋白，进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，12%的分离胶分离MAL蛋白，电泳后采用半干式转移法转移到聚偏二氟乙烯膜上，膜用5%的脱脂牛奶37℃封闭1h，加入一抗MAL抗体（1∶1 000），37℃孵育1h,加入HRP标记的兔抗鼠二抗（1∶1 000），37℃孵育1h,β-actin单克隆抗体（1∶100）作为内参照，孵育3h，用ECL化学发光试剂盒检测杂交信号（17KD附近出现特异性条带，则视为MAL蛋白表达阳性）。（3）MSP：酚一氯仿法提取基因组DNA进行亚硫酸氢钠修饰，DNA纯化系统对修饰后的DNA标本进行纯化，再次碱变性后乙醇沉淀，溶解后用于PCR扩增模板。PCR产物加于2.0%琼脂糖凝胶中电泳，0.1%EB染色，凝胶成像系统照相分析（甲基化扩增片段139bp，非甲基化扩增片段142 bp，若甲基化引物扩增出目的条带，则视为MAL基因启动子发生甲基化）。

1.5 观察指标观察比较大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中MAL mRNA、蛋白表达情况及其启动子甲基化状态。

1.6 统计学处理应用SPSS19.0统计软件；计数资料以构成比表示，组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中MAL mRNA表达情况比较大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中MAL mRNA表达电泳图见图1。

图1 大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中MAL mRNA表达电泳图（1、2：正常大肠组织；3、4：癌旁组织；5、6：大肠癌组织；1、3、5：β-actin；2、4：阳性条带；6：阴性条带）

由图1可见，RT-RCR结果显示大肠癌组织中MAL mRNA表达阳性率（10.0%，4/40）均低于其在癌旁组织（75.0%，30/40）和正常大肠组织（100.0%，10/10）中的表达阳性率（均P＜0.05）。且MAL mRNA在癌旁组织中的表达阳性率亦低于在正常大肠组织中的表达阳性率（P＜0.05）。

2.2 大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中MAL蛋白表达情况比较大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中MAL蛋白表达情况电泳图见图2。

图2 大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中MAL蛋白表达情况电泳图（1、2：大肠癌组织；3：正常大肠组织；4：癌旁组织）

由图2可见，Western blot结果显示正常大肠组织抗原的17KD附近有特异性条带，15.0%（6/40）的癌旁组织特异性条带或缺少或条带较弱，80.0%（32/40）的大肠癌组织无特异性条带出现。即大肠癌组织中MAL蛋白表达阳性率（20.0%，8/40）均低于其在癌旁组织（85.0%，34/40）和正常大肠组织（100.0%，10/10）中的表达阳性率（均P＜0.05）。且MAL蛋白在癌旁组织中的表达阳性率亦低于在正常大肠组织中的表达阳性率（P＜0.05）。

2.3 大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中MAL基因启动子甲基化状态比较大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中MAL基因启动子甲基化状态比较电泳图见图3。

图3 大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中MAL基因启动子甲基化状态比较电泳图（1：癌旁组织；2：大肠癌组织；3：正常大肠组织；u：Unmethylated；m：Methylated；M：Maker）

由图3可见，MSP结果显示大肠癌组织中MAL基因启动子甲基化率（90.0%，36/40）均高于其在癌旁组织（40.0%，16/40）和正常大肠组织（0.0%，0/10）中的甲基化率（均P＜0.05）。且MAL基因启动子在癌旁组织中的甲基化率亦高于在正常大肠组织中的甲基化率（P＜0.05）。

3 讨论

大肠癌是我国国民常见的恶性肿瘤，发病率高居恶性肿瘤的前5位，且呈逐年上升趋势。大肠癌的发病机制是研究的热点，特别是在分子水平上对其进行探索，如多种癌基因和抑癌基因陆续被发现。MAL基因是于1987年发现的抑制肿瘤生长的基因，MAL基因定位于2q13，含4个外显子，其cDNA全长为1 051bpa，MAL蛋白是T淋巴细胞成熟相关蛋白，肿瘤的发生可能与MAL基因启动子高度甲基化有关[3-6]。

本研究将经病理学检查确诊的大肠癌手术切除标本、相应的癌旁组织各40例，以及正常成人大肠组织10例作为研究材料，探讨MAL mRNA、蛋白的表达情况以及MAL基因启动子甲基化状态。结果显示大肠癌组织中MAL mRNA、蛋白的表达阳性率均低于其在癌旁组织和正常大肠组织中的表达阳性率，而大肠癌组织中MAL基因启动子甲基化率均高于其在癌旁组织和正常大肠组织中的甲基化率。因而，笔者推测MAL基因在大肠癌组织中表达失常影响了正常蛋白质的表达水平，从而直接或间接的参与了大肠癌的发生，MAL基因启动子甲基化可能是大肠癌发生的早期事件。

综上所述，肿瘤的发生、发展机制非常复杂，基因启动子甲基化可能是肿瘤重要机制之一[6]。本研究结果显示在大肠癌组织中，MAL基因启动子甲基化导致MAL基因失活，影响MAL mRNA表达，进而引发MAL蛋白表达失常，间接导致大肠癌的发生、发展。当然，确定MAL基因是否能作为大肠癌筛查的分子标志物及其对大肠癌早期诊断的价值尚需实验室及临床更深入研究。

[1]马炯,杨青兰,邓超金,等.结直肠肿瘤DNA甲基化标志的筛选及诊断价值[J].中华胃肠外科,2015,18(11):1149-1153.

[2]Shahzad N,Shuda M,Gheit T,et al.The T antigen locus of Merkel cell polyomavirus downregulates human Toll-like receptor 9 expression[J].Virol,2013,87(10):13009-13019.

[5]Abdel-Rahman W M,Ruosaari S,Knuutila S,et al.Differential roles of EPS8 in carcinogenesis:loss of protein expression in a subset of colorectal carcinoma and adenoma[J].World J Gastroenterol,2012,18(7):3896-3903.

[6]滕玥,戴冬秋,沈文静.hMLH1基因启动子区甲基化在胃癌阶段性发生发展中的作用[J].中华胃肠外科,2015,18(2):166-170.

Expression of MAL gene and status of its promoter methylation in colorectal carcinoma

Objective To investigate the expression of MAL gene and the status of its promoter methylation in colorectal cancer.MethodsThe expression of MAL mRNA and protein and status of promoter methylation in 40 samples of colorectal carcinoma and corresponding adjacent tissues were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR), Western blot and methylation specific PCR,respectively.Ten samples of normal colorectal tissue were used as controls.ResultsThe expression rates of MAL mRNA and protein in colorectal cancer tissues(10.0%,20.0%)were lower than those in adjacent tissues(75.0%,85.0%)and normal colorectal tissues(100.0%,100.0%)(allP＜0.05).The methylation rate of MAL promoter in colorectal cancer tissues(90.0%)was higher than that in adjacent tissues(40.0%)and normal colorectal tissues(0.0%)(allP＜0.05).ConclusionMAL gene is down-regulated in colorectal carcinoma,suggesting that it might be used as a molecular marker for screening and early diagnosis of colorectal cancer.

Colorectal carcinoma MAL gene Tumor-suppressor gene DNA methylation