儿童急性B淋巴细胞白血病致癌基因FGFR3表达对预后的影响研究
2017-02-17吴静怡周剑峰裴仁治张丕胜刘旭辉杜小红
吴静怡 周剑峰 裴仁治 张丕胜 刘旭辉 杜小红
儿童急性B淋巴细胞白血病致癌基因FGFR3表达对预后的影响研究
吴静怡 周剑峰 裴仁治 张丕胜 刘旭辉 杜小红
目的 分析急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因的表达情况,探讨其在疾病预后判断中的意义。方法采用实时定量PCR法检测52例B-ALL患儿(B-ALL组)与12例对照儿童(对照组)骨髓血中B淋巴细胞FGFR3基因表达水平;并以B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平的中位数为界,将B-ALL组患儿分为FGFR3基因高表达组和FGFR3基因低表达组。比较FGFR3基因高表达组和FGFR3基因低表达组患儿的各项临床指标;随访36个月,比较两组患儿的无事件生存(EFS)率。采用流式细胞术检测B淋巴细胞免疫分型、巢式PCR法检测B淋巴细胞融合基因,比较不同B淋巴细胞免疫分型及融合基因的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平。结果B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平高于对照组儿童(1.637±0.903 vs 0.645±0.559,P<0.05)。FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿性别、年龄、外周血WBC、肝脾有无肿大、有无髓外浸润、B淋巴细胞免疫分型及染色体核型等临床指标比较均无统计学差异(均P>0.05)。FGFR3基因高表达组患儿EFS率低于FGFR3基因低表达组患儿(49.97%vs 76.17%,P<0.05)。B-ALL组患儿中,CD34+患儿FGFR3基因表达水平高于CD34-患儿(P<0.05),BCR/ABL+患儿FGFR3基因表达水平高于BCR/ABL-患儿(P<0.05)。结论FGFR3基因高表达与肿瘤发生、发展有关,有望成为辅助评价儿童B-ALL预后的指标。
急性B淋巴细胞白血病 FGFR3 预后
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体,在细胞生长、分化、迁移及血管发生、伤口愈合等生理、病理过程中发挥重要作用[1]。FGFR3是FGFR家族一员,其在膀胱癌中高表达,且与肿瘤转移及淋巴结浸润密切相关[2]。有学者发现约25%多发性骨髓瘤患者发生t(4;14)(p16.3;q32.3)基因易位,导致FGFR3基因过度表达而致瘤[3]。FGFR3基因定位于染色体4pl 6.3,跨越16.5 kb,共含19个外显子,是已被确认的致癌基因。本研究旨在分析FGFR3基因在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿B淋巴细胞中的表达情况,探讨其在疾病预后判断中的意义,现报道如下。
1 对象和方法
1.1 对象 选取2006年6月至2015年3月在宁波大学医学院附属鄞州医院初诊的B-ALL患儿52例(BALL组),采用MICM分型诊断。其中男33例,女19例;年龄0.25~16岁,中位年龄10岁;同时记录患儿初诊时外周血WBC、PLT、肝脾有无肿大、有无髓外浸润、B淋巴细胞免疫分型及染色体核型等临床指标。患儿均按《儿童ALL诊疗建议》[4]进行危险度分组,并参照该建议治疗;1个疗程结束后,根据《血液病诊断及疗效标准》[5]评价疗效,随访3年。选取同期健康儿童10例及缺铁性贫血患儿2例作为对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准,患儿、对照儿童监护人均知情同意并签署知情同意书。
1.2 试剂和仪器 人淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物工程医学研究所,Trizol试剂购自美国Invitrogen公司,RNA酶抑制剂购自华美生物工程公司,M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司,Taq DNA聚合酶购自加拿大Fermentas公司,SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自上海东洋纺生物科技有限公司,所有流式试剂均购自美国BD公司。PRISM 7300实时定量PCR仪购自美国ABI公司,ChemilmagerTM5500型凝胶成像分析系统购自美国Alpha Innotech公司,四色数字化流式细胞购自美国Beckman Coulter公司。
1.3 方法
1.3.1 FGFR3基因实时定量PCR检测 抽取B-ALL组患儿及对照组儿童骨髓血3~5ml,淋巴细胞分离液分离骨髓B淋巴细胞,Trizol一步法抽取总RNA,按试剂盒说明书操作步骤合成cDNA链。FGFR3基因上游引物5′-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3′,下游引物5′-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3′,扩增片段长度110bp。内参GAPDH基因上游引物5′-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3′,下游引物5'-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3′,扩增片段长度150bp。20μl反应体系中含 cDNA 2μl、FGFR3及 GAPDH上下游引物(10μmol/L)各0.5μl,每份标本均设2个复孔,每板同时设质控对照组、阳性对照组和阴性对照组。PCR反应条件:95℃预变性10s,95℃变性10s,60℃退火30s,72℃延伸10s,40个循环,目的基因和内参基因的扩增效率基本一致。按照相对定量法计算目的基因的相对拷贝数即表达水平,具体公式为2-△△ct,其中△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值,△△Ct=待测标本△Ct值-标准品△Ct值。并以B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平的中位数为界,将B-ALL组患儿分为FGFR3基因高表达组和FGFR3基因低表达组。
1.3.2 染色体核型分析 24h培养法制备B-ALL组患儿骨髓B淋巴细胞染色体,采用G带技术显带,分析细胞数20个。根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN1995)》描述核型,包括正常二倍体、超二倍体、亚二倍体、假二倍体。
1.3.3 B淋巴细胞免疫分型检测 应用四色数字化流式细胞仪和相应的配套试剂检测B淋巴细胞的免疫分型。所有B-ALL组患儿标本均先以CD45设门,选定CD45弱阳性和侧向角散射较小区域细胞进行分析。
1.3.4 B淋巴细胞融合基因检测 参照文献[6]报道的巢式PCR方法,同时检测B-ALL组患儿骨髓B淋巴细胞融合基因。扩增产物取10μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,凝胶成像扫描系统分析,根据特异条带的有无分别记为阳性和阴性。
1.4 观察指标 (1)比较B-ALL组患儿与对照组儿童FGFR3基因表达水平。(2)比较FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿各临床指标(性别、年龄、外周血WBC、肝脾有无肿大、有无髓外浸润、B淋巴细胞免疫分型及染色体核型)。(3)患儿随访36个月,中位随访时间18个月,观察比较FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿疾病预后。其中无事件生存(EFS)率定义为患儿自确诊之日起至任何事件发生(包括复发、第二肿瘤或死亡)或末次随访日期,若患儿治疗效果未达完全缓解,其EFS率为0.00%。(4)比较不同B淋巴细胞免疫分型及融合基因的 B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平。
1.5 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件;计量资料以表示,两组比较采用t检验;计数资料以构成比表示,两组比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。采用Kaplan-Meier法估计患者的EFS率并绘制生存曲线,两组患者EFS率的比较采用log-rank检验。
2 结果
2.1 B-ALL组患儿与对照组儿童FGFR3基因表达水平比较 B-ALL组患儿与对照组儿童FGFR3基因表达水平分别为1.637±0.903、0.645±0.559,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),即B-ALL患儿FGFR3基因表达水平高于对照儿童。
2.2 FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿各项临床指标比较 实时定量PCR检测结果提示,FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿各有26例。两组患儿各临床指标比较见表1。
由表1可见,两组患儿性别、年龄、外周血WBC、肝脾有无肿大、有无髓外浸润、B淋巴细胞免疫分型及染色体核型等临床指标比较均无统计学差异(均P>0.05)。
2.3 FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿疾病预后比较 两组患儿生存曲线见图1。
图1 FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿生存曲线
由图1可见,FGFR3基因高表达组与与FGFR3基因低表达组患儿EFS率分别为49.97%、76.17%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),即FGFR3基因高表达组患儿EFS率低于FGFR3基因低表达组患儿。
2.3 不同B淋巴细胞免疫分型的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平比较 流式细胞术检测到B-ALL组患儿B淋巴细胞免疫分型包括CD10、CD20、CD22、CD34、CD38。不同B淋巴细胞免疫分型的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平比较见表2。
表1 FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿各临床指标比较[例(%)]
表2 不同B淋巴细胞免疫分型的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平比较
由表2可见,B-ALL组患儿中,CD34+患儿FGFR3基因表达水平高于CD34-患儿(P<0.05)。
2.4 不同B淋巴细胞融合基因的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平比较 巢式PCR法检测到BALL组患儿B淋巴细胞融合基因包括HLA-DR、BCR/ ABL及TEL/AML1。不同B淋巴细胞融合基因的BALL组患儿FGFR3基因表达水平比较见表3。
表3 不同B淋巴细胞融合基因的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平比较
由表3可见,B-ALL组患儿中,BCR/ABL+患儿FGFR3基因表达水平高于BCR/ABL-患儿(P<0.05)。
3 讨论
FGFR3属于酪氨酸激酶家族,生理条件下与配体结合后形成二聚体,激活细胞内酪氨酸激酶,参与细胞的生长、分化及迁移。在肿瘤组织中,FGFR3基因发生突变导致以受体非依赖的方式异常激活,有研究发现约35%膀胱癌及25%宫颈癌组织存在FGFR3基因的突变[7]。而在血液系统恶性疾病如慢性髓细胞白血病、浆细胞白血病和多发性骨髓瘤中也发现FGFR3基因的过表达[8-9]。如将FGFR3基因高表达的骨髓细胞植入经致死性照射的小鼠体内,所有移植后的小鼠都出现了恶性的血液表型,包括淋巴细胞和髓系的恶性表型[10]。这些前期研究均提示FGFR3作为一种致癌基因与肿瘤的发生、发展密切相关。本研究结果显示,与对照组儿童相比,B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平较高。对BALL组患儿的随访也发现,FGFR3基因高表达组患儿EFS率低于FGFR3基因低表达组患儿。
本研究发现B-ALL组患儿中,BCR/ABL+患儿FGFR3基因表达水平高于BCR/ABL-患儿。Dvorakova等[11]发现慢性粒细胞白血病患者治疗后BCR/ABL拷贝数下降,FGFR3基因表达水平明显下降至正常水平,当白血病复发或进入加速期后,FGFR3基因表达水平会随BCR/ABL拷贝数上升而明显升高。两者在肿瘤细胞增殖过程中有明显的相关性,另外值得注意的是BCR/ ABL酪氨酸酶是依赖Ras信号途径激活,而FGFR3基因的激活途径是Ras非依赖性的,因此FGFR3基因的异常激活很可能进一步激活BCR/ABL酪氨酸酶,导致细胞增殖。
本研究亦发现 B-ALL组患儿中,CD34+患儿FGFR3基因表达水平高于CD34-B-ALL患儿。CD34抗原起源于早期造血干细胞,分化成熟后逐渐消失,在儿童ALL中表达明显高于成人。尽管目前儿童急性淋巴细胞白血病中CD34与预后关系尚不明确,但这仍提示来源于早期造血细胞的恶性克隆更容易出现致癌基因FGFR3的异常表达。国外学者在慢性粒细胞白血病患者CD34+细胞及健康供者CD34+外周血干细胞中均发现FGFR3基因的异常高表达[12],这与本研究观察到的现象一致。
综上所述,本研究结果显示FGFR3基因高表达与肿瘤发生、发展有关,有望成为辅助评价儿童B-ALL治疗效果及预后的指标。FGFR3基因及其表达产物的抑制剂或可作为抗肿瘤治疗重要的靶向药物,值得临床及实验室进一步研究。
[1]Turo R,Harnden P,Thyqesen H,et al.FGFR3 expression in primary invasive bladder cancers and matched lymph node metastases[J].J Urol,2015,193(1):325-330.
[2]Elizabeth A Guancial,Lillian Werner,Joaquim Bellmunt,et al. FGFR3 expression in primary and metastatic urothelial carcinoma of the bladder[J].Cancer Med,2014,3(4):835-844.
[3]Chesi M,Brents L A,Ely S A,et al.Activated fibroblast growth factor receptor 3 is an oncogene that contributes to tumor progression in multiple myeloma[J].Blood,2001,97(3):729-736.
[4]中华医学会儿科分会血液组.儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议[J].中华儿科杂志,2006,44(5):392-395.
[5]张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].3版.北京:科学技术出版社, 2008:172-173.
[6]黄梅,李春蕊,周剑峰,等.多重巢式RT-PCR检测90例恶性血液病常见染色体融合基因分析[J].中华内科杂志,2006,45(3):236-237.
[7]Wu R,Connolly D,Ngelangel C,et al.Somatic mutation of fibroblast growth factor receptor 3(FGFR3)are uncommon in carcinomas of the uterine cervix[J].Oncogene,2000,19(48):5543-5546.
[8]Dvorak P,Dvorakova D,Doubek M,et al.Increased expression of fibroblast growth factor receptor 3 in CD34+BCR-ABL+cells from patients with chronic myeloid leukemia[J].Leukemia,2003,17 (12):2418-2425.
[9]Richelda R,Ronchetti D,Baldini L,et al.A novel chromosomal translocation t(4;14)(p16.3;q32)in multiple myeloma involves the fibroblast growth-factor receptor 3 gene[J].Blood,1997,90(10): 4062-4070.
[10]Li Z,Zhu Y X,Plowright E E,et al.The myeloma-associatedoncogene fibroblast growth factor receptor 3 is transforming in hematopoietic cells[J].Blood,2001,97(8):2413-2419.
[11]Dvorakova D,Krejci P,Mayer J,et al.Changes in the expression of FGFR3 in patients with chronic myeloid leukaemia receiving transplants of allogeneic peripheral blood stem cells[J].Br J Haematol,2001,113(3):832-835.
[12]Dvorak P,Dvorakova D,Doubek M,et al.Increased expression of fibroblast growth factor receptor 3 in CD34+BCR-ABL+cells from patients with chronic myeloid leukemia[J].Leukemia,2003, 17(12):2418-2425.
Expression of FGFR3 gene in childhood acute B lymphoblastic leukemia and its relation to disease progression
Objective To investigate the expression of fibroblast growth factor receptors 3(FGFR3)gene in childhood acute B lymphoblastic leukemia(B-ALL),and its clinical significance in disease progression.MethodsThe expression levels of FGFR3 in 52 children with B-ALL and 12 normal children were assayed by real time RT-PCR.Clinical indicators were compared between patients with high FGFR3 expression and those with low FGFR3 expression.Patients were followed up for 36 months. The event-free survival(EFS)rate was compared with single factor analysis between two groups.B lymphocyte immune classification was detected by flow cytometry and B lymphocyte fusion gene was detected by nested PCR.The expression levels of FGFR3 were compared among different immune classification and fusion gene groups.ResultsFGFR3 was over-expressed in children with B-ALL compared with normal controls (1.637±0.903 vs 0.645±0.559,P<0.05).There were no significant differences in sex,age,peripheral blood WBC count,hepatosplenomegaly,extramedullary infiltration,B lymphocyte immune classification and karyotype between low FGFR3 group and high FGFR3 group(P>0.05).The probability of 3-year EFS for patients with high FGFR3 level was significantly lower than that with low FGFR3 level(49.97%vs 76.17%,P<0.05).Expression levels of FGFR3 were significantly different between BCR/ABL+group and BCR/ABL-group(P<0.05)and between CD34+group and CD34-group(P<0.05).ConclusionOver-expression of FGFR3 may participate in malignant hematopoiesis and the detection of FGGR3 expression might be helpful in evaluation of disease progression in childhood acute B lymphoblasticleukemia.
Acute B lymphoblastic leukemia Fibroblast growth factor receptor 3 Progression
2015-12-10)
(本文编辑:李媚)
浙江省自然科学基金资助项目(LQ12H08001);浙江省医药卫生科技项目(2012KYB186);宁波市自然科学基金项目(2012A610236);宁波市医学科技计划项目(2011B23)
315000 宁波大学医学院附属鄞州医院血液内科(吴静怡、裴仁治、张丕胜、刘旭辉、杜小红);华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科(周剑峰)
裴仁治,E-mail:peirz@163.com