基于分子对接技术虚拟筛选菊苣与肠道CNT2结合的化学成分研究

周月+张冰+林志健+张晓朦+李凡+王海鸽+王雪洁

[摘要]利用分子对接技术虚拟筛选菊苣与肠道浓度型核苷转运蛋白2（CNT2）结合的化学成分，为探讨菊苣干预嘌呤核苷吸收的降尿酸作用机制研究提供理论依据。采用同源建模手段构建人CNT2三维结构模型，采用Vina软件虚拟筛选菊苣小分子化合物作用于CNT2的化学成分。以CNT2抑制剂7，8，3′-三羟基黄酮的打分为阈值，筛选出23个打分高于阳性抑制剂的菊苣化学成分。其中打分靠前的菊苣化合物是菊苣降尿酸作用的重要化合物，其能否通过抑制CNT2活性干预肠道嘌呤核苷的吸收降低体内尿酸水平有待生物学实验进一步探讨。CNT2可能是菊苣降尿酸的效用靶点，为指导实验研究菊苣干预嘌呤核苷吸收降尿酸研究提供向导。

[关键词]同源建模； 富集型核苷转运蛋白2； 菊苣； 虚拟筛选； 高尿酸血症

[Abstract]To virtual screen the compound of Chicory combined with the concentrative nucleoside transporter 2 （CNT2） in molecular docking technology.The homology model of hCNT2 was produced， and then the Vina software was employed to virtual screen the Chicory compound combined with CNT2. Compared with 7，8，3′-trihydroxyflavone， a CNT2 inhibitors， 23 score higher chicory compounds were hit.Meanwhile， the ten top compounds have been revealed that play important role in decrease the uric level. The bioactivity to CNT2 needs to be investigatedin experiment. CNT2 may be a potential target of chicory， which decreases the absorption of purine nucleoside in intestinal tract.

[Key words]homology modeling； CNT2； Chicory； virtual screening； hyperuricemia

doi：10.4268/cjcmm20162113

肠道是嘌呤核苷吸收转运的重要场所。浓度型核苷转运蛋白2（concentrative nucleoside transporter 2，CNT2）是肠道摄入嘌呤核苷的核心转运体，控制着尿酸生成的前体物质外源性嘌呤核苷的摄入，抑制肠道CNT2的转运可降低体内血尿酸水平，可能成为药物降尿酸的潜在作用靶点^[1]。目前，尚未获得哺乳动物CNT2的蛋白晶体结构，已解析的霍乱弧菌CNTs蛋白晶体结构满足人源CNT2蛋白同源建模的要求。因此，本研究以嘌呤核苷转运蛋白为靶点，采用同源建模和分子对接技术虚拟筛选菊苣作用于嘌呤核苷转运蛋白的小分子化合物，以期为指导开展实验研究菊苣干预嘌呤核苷吸收的降尿酸作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 浓度型核苷转运蛋白2的三维结构模型构建

1.1.1 hCNT2同源模型构建 以人源CNT2（hCNT2，NP_004203.2）在NCBI蛋白质数据库中用PSI-BLAST在Protein Data Bank数据库进行序列相似性搜索。同源模建使用Modeller 9.15程序和 EasyModeller 4.0图形操作界面，由程序自动生成 5个模型，根据打分值选取molPDF值及DOPE Score均最低的模型作为目标蛋白。蛋白三维结构的显示采用 Discovery Studio 3.5 Client程序。

1.1.2 分子力学优化 本研究使用GROMACS5.1程序包在Amber力场先进行3 000步最陡下降法（steepest descent）再进行1 000步共轭梯度法（conjugategradient）进行能量优化，以消除同源模建模型存在的一些不合理因素。最终模型切去第1～74和第584～658个氨基酸。

1.1.3 模型评价与驗证 模型评价主要采用SAVES在线工具的ProCheck考察模型立体化学质量。同时，使用Autodock 4.2分子对接软件将10个实验获得的已知hCNT2抑制剂^[2]（8-腺嘌呤核苷衍生物，IC50 0.64～52 μmol·L^-1）与模型对接验证模型的可靠性。参阅文献，10个hCNT2抑制剂采用ChemDraw绘制，在MM2力场进行能量最小化，并保存为 PDB 格式备用。对接前设置小分子可扭转键保持柔性，添加电荷并以 PDBQT 格式存储。

1.2 菊苣小分子虚拟筛选

菊苣小分子配体来自课题组前期建立的菊苣小分子化合物库，包括253个化学成分，主要涉及黄酮类、酚酸类、倍半萜类等成分^[3]。考虑到菊苣化合物结构类型，以文献报道的黄酮类hCNT2抑制剂7，8，3′-三羟基黄酮作为阳性对照药^[4]。从ZINC 数据库中下载黄酮类hCNT2抑制剂（cas code），并利用ChemBio3D软件进行MM2力场优化，保存成PDB格式备用，对接前设置小分子可扭转键保持柔性，添加电荷最后以 PDBQT 格式存储。使用Vina分子对接软件进行虚拟筛选。

2 结果与分析

2.1 同源模型构建与评价

同源序列搜索比对结果显示，hCNT2与霍乱弧菌的CNTs（vibrio cholera CNT，code：4PB1和3JTI）的一致性（identity）为37%，相似性（positives）为57%，空位百分数（Gaps）为5%，满足同源建模和用于虚拟筛选及小分子配体对接的前提条件^[5]。以4PB1和3JTI为模板，利用Modeller进行多模板建模、Loop 优化，得到初级三维模型。再应用Gromacs进行能量最小化。由于hCNT2第1～74个和第585～658个氨基酸序列没有一致性较高的模板，经跨膜区域预测显示这2段氨基酸处于两端，同时距离转运蛋白结合底物位点较远，切除以上2处氨基酸序列得到最终三维模型。Prochek程序得出的拉氏图结果显示97.8%的氨基酸落在最佳允許区（79.4%）和允许区（18.4%），1.7%的氨基酸落在一般允许区，仅0.4%的氨基酸落在不允许区，说明得到的hCNT2模型氨基酸二面角结构比较合理（氨基酸残基骨架的二面角分布见图1）。

2.2 同源模型验证

在活性位点设置方面，嘌呤核苷结合位点主要位于第7和第8跨膜螺旋区。研究表明：将hCNT1转运蛋白的第7和第8跨膜螺旋区上氨基酸残基Ser319/Gln320和Ser353/Leu354定点突变成hCNT2相应位置的残基（Gly313/Met314和Thr347/Val348）后将从嘧啶核苷转运体变成嘌呤核苷转运体^[6]。因此，Gly313， Met314， Thr347和Val348为底物识别的关键氨基酸。选择分子对接活性位点和盒子大小时，将Gly313， Met314，Thr347和Val348，以及vcCNTs蛋白结合、转运底物的重要功能氨基酸相对应的hCNT2序列上的Thr315， Glu316， Glu492， Phe536， Asn538和Ser541残基含括在盒子^[7-8]。调整对接位点，最终Gird Box 中心坐标在x， y和z方向设置为216.866， 189.261 和 80.029，盒子大小为 40×50×50（每个格点距离为0.375 nm）。采用拉马克遗传算法进行构象搜索，初始种群数设置为 150，能量评定最大次数为250万，每个分子配体都设定得到50个构象，其他参数选择默认值，进行半柔性对接，评分函数为半经验的自由能计算方法。将10个已知的hCNT2抑制剂与模建模型进行对接，结果显示AutoDock给出的自由能大小排序与实验测得的IC50较为一致，同时根据△G≈-RTln（IC50），将AutoDock的自由能打分函数与实验测得抑制剂生物活性（-lgIC50）进行相关性分析，辅助说明同源模型识别底物的可靠性，结果显示R²=0.91，表明模建模型质量可靠，分子对接参数设置合理，在一定程度上可区分活性不同的化合物，可用于菊苣化学成分的虚拟筛选研究。10个化合物结构见图2，打分函数结果见表1。

2.3 菊苣化学成分虚拟筛选

最终筛选出21个得分高于阳性药（7，8，3′-三羟基黄酮）的化合物，按照打分高低依次为3，4-二咖啡酰奎宁酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、1，4-二咖啡酰奎宁酸、菊苣苷-6-对羟基苯乙酰、菊苣酸、橙黄胡椒酰胺、菊苣萜苷K、山莴苣苦素、5，6，7，3′，4′，7′-7-O-β-D-glucopyranoside-heaxahyrosy-flavone、3′-羟基-4′-甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基二氢黄酮、4-O-咖啡酰基奎宁酸、3，4β-dihydro-15-dehydrolactucopicrin、菊苣萜苷N、矢车菊素-3-葡萄糖苷、2，6-di[but-3（E）-en-z-only]naphthalene、11β，13-二氢山莴苣苦素、lactupicrin-15-al、epi-8α-angeloyloxy-cichoralexin、3-O-p-coumdroyl quinic acid。化合物详细信息及其类别详见表2。使用Pymol软件及ligplot软件分析观察菊苣化合物与模建蛋白的对接结果，由于篇幅限制仅展示打分结果排名前9个化合物与模建蛋白hCNT2对接结果，见表3。

3 讨论

肠道CNT2在嘌呤核苷吸收中发挥重要作用，抑制肠道CNT2活性可减少外源性嘌呤核苷的摄入而降低血尿酸水平。因此，CNT2是防治高尿酸血症的药物作用新靶点。本研究切入CNT2嘌呤核苷转运蛋白，采用同源建模方法构建人CNT2的三维结构模型，采用分子对接软件虚拟筛选了菊苣与CNT2相结合的化学成分，并分析了其与转运蛋白的作用结合模式，从干预外源性嘌呤核苷摄入角度初步探讨中药菊苣降尿酸作用的潜在效用靶点。

在hCNT2靶蛋白结构建模方面，哺乳动物CNT2蛋白的晶体三维结构目前尚未解析出来，但是近年源于霍乱弧菌的CNTs转运蛋白的X射线晶体结构已被解析出来^[7-8]。vcCNTs不但转运机制与hCNT2相同，均是钠离子梯度转运，而且与hCNT2具有37%的一致性，尤其是在核苷结合位点与hCNT2具有73%的一致性。满足同源建模序列一致性不低于30%的要求。因此，本研究利用vcCNTs晶体结构同源构建hCNT2靶蛋白结构，首次虚拟筛选菊苣结合hCNT2的化学成分。

在模型可靠性验证方面，本文选择活性已知的10个8-氨基腺苷衍生物与hCNT2模建模型进行分子对接，以间接说明hCNT2模建模型的可靠性。目前，选择性hCNT2抑制剂相对较少，尚无成熟的药物上市，主要为核苷类衍生物和黄酮类化合物。Masahiro等^[1]证实合成的核苷类衍生物KGO-2143和KGO-2173可抑制hCNT2活性，从而抑制饮食源性嘌呤引起的血尿酸水平的升高。Tatani等^[2]进一步合成hCNT2抑制剂腺苷衍生物，筛选出8-氨基腺苷衍生物对hCNT2具有较好的抑制作用，其中biphenyl-4-yl-8-aminoadenosine活性最好，其半数抑制浓度达（0.64±0.19）μmol·L^-1。本研究结果显示hCNT2模建模型对活性不同的抑制剂化合物具有一定的识别作用，可以为菊苣化学成分的筛选提供可靠的靶蛋白结构。

在菊苣成分筛选结果方面，本研究从菊苣中筛选出了与CNT2结合且打分较高的9个酚酸类和8个倍半萜类化合物。菊苣主要含有酚酸类、倍半萜类和黄酮类化合物以及多糖类物质。其中，酚酸类成分主要为咖啡酸衍生物，如菊苣酸， 3，5-二咖啡酰奎宁酸，4，5-二咖啡酰奎宁酸和1，3-二咖啡酰奎宁酸等，是菊苣发挥降尿酸作用的重要化学成分。朱春胜等^[9]采用“谱效关系”手段研究了菊苣降尿酸药效的物质基础，表明色谱图中峰 2（绿原酸）， 3， 5（菊苣酸）， 6， 7， 8与菊苣降尿酸作用密切相关。李英等^[10]研究了菊花中酚酸类和黄酮类成分对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用，显示3，4-二咖啡酰奎宁酸甲酯、1，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸等对黄嘌呤氧化酶活性具有较好的抑制作用。倍半萜类成分是菊苣中含量最高的一类化合物。实验室前期采用分子对接技术研究菊苣小分子化学成分对黄嘌呤氧化酶的抑制作用，筛选出山莴苣苦素、山莴苣苦素乙酯和11β，13-二氢山莴苣苦素等24个倍半萜类化合物。同时，选择山莴苣苦素开展的生物学实验证实山莴苣苦素可以显著降低高嘌呤饮食诱导的高尿酸血症模型鹌鹑的血尿酸水平。但是，尚没有菊苣相关化学成分与CNT2作用的实验研究。因此，作者认为应进一步开展体外活性试验验证虚拟筛选出的菊苣化合物对CNT2活性的抑制作用。

4 结论

采用分子对接技术虚拟筛选与hCNT2结合的菊苣小分子化合物，最终得到23个打分较高的化合物，表明肠道嘌呤转运蛋白可能是菊苣降尿酸的作用靶点。而且，打分靠前的菊苣化合物是菊苣发挥降尿酸作用的重要成分，需开展生物学实验进一步验证其对肠道CNT2转运的抑制作用，为指导实验研究菊苣干预嘌呤核苷吸收降低血尿酸的作用机制提供直观的理论依据与导向。

[参考文献]

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[9]朱春胜，林志健，张冰，等. 菊苣降尿酸作用的谱效关系研究[J]. 中草药， 2015， 46（22）： 3386.

[10]李英，陈君，李萍.金银花中酚酸类和黄酮类成分的黄嘌呤氧化酶抑制活性[J].中国药科大学学报， 2011（5）：407.

[责任编辑 丁广治]