生物样本库中血液RNA提取方法的介绍

章佳英，嵇承栋，万悦竹，付强强，朱琳懿

生物样本库中血液RNA提取方法的介绍

章佳英，嵇承栋，万悦竹，付强强，朱琳懿

RNA 在人类的多种生理和病理过程中发挥着举足轻重的作用[1-2]。随着第二代测序技术的发展[3]，针对人类不同疾病的 RNA 样本测序研究广泛开展，并得到了大量有价值的发现。高质量的 RNA 可以满足 RT-PCR、qRT-PCR、Northern blot、基因表达谱、转录组测序、核酸酶保护实验和阵列分析等生物学下游实验的研究需求[4-5]。

在脊椎动物中，外周血一直被认为是侵害性较小、较有价值的 RNA 来源[6-7]。在许多生物样本库中，由于血液样本的常规收集、处理及保存方法简便、成本低且富含可利用成分（如血清、血浆、白细胞和红细胞等）和生物分子（DNA、RNA、蛋白质和代谢产物），因此是进行多个项目分析的理想实验材料。然而，RNA 极易降解，许多因素如内源性和外源性的 RNA 酶、预处理、保存和提取过程，可能会不同程度地影响 RNA 实验结果。因此，必须注意样本收集、处理和储存过程中的各个环节，从根本上确保获得高质量的RNA[8]。

以前的研究比较了不同采样技术或提取方法对 RNA的影响[9-10]，但是尚无关于血液样本 RNA 抽提的系统报道。因此，本文评估各种不同采样技术结合提取方法，比较不同方法对血液 RNA 产量和质量的影响。本研究目的是找到最合适的血液 RNA 提取方案，以便在生物样本库中作批量应用。

1 RNA 提取方法

常见的 RNA 提取方法有苯酚法、阴离子去污剂法、热硼酸法或改良热硼酸法、LiCl-尿素法、改良的 Gomez 法、异硫氰酸胍法、TRIzol 试剂快速提取法、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法。

随着生物技术的不断发展，很多生物技术公司着手RNA 提取试剂盒的研究并取得丰硕成果，将科研人员从繁琐的提取、纯化工作中解放出来。目前，RNA 提取中常用的试剂盒主要分为 3 种：TRIzol 试剂一步法、TRIzol LS 试剂一步法和 PAXgene 试剂盒法，前两者均使用苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液，而 PAXgene 法需根据试剂生产商说明书操作。

近年来，RNA 提取方法有了很大改进[11]，本文选取12 种具有代表性的提取方法进行系统比较（表 1），其中Liu 等[12]系统地比较了其中 6 种方法（A ～ F），提取过程见图 1；而 Häntzsch 等[13]比较了另外 6 种方法（G ～ L）（图 2），其中，手工法 4 种和半自动法 2 种。

表 1 分离方法汇总

全血基因的表达谱通常用 PAXgene 或 Tempus 血液采集管研究[14-15]，Häntzsch 等[13]比较了不同提取系统（filter-based vs magnetic beads；手工 vs 自动）结合PAXgene 和 Tempus 血液 RNA 采集管的 RNA 数量和质量，计算不同提取方法所耗费的时间，以及每个样本的处理时间，评估 mRNA 和 miRNA 的表达与 RNA 提取方法、RT-PCR 和 qRT-PCR 试剂之间的关系。

图 1 RNA 的前处理及分离过程

图 2 Häntzsch 等[13]的研究设计

随着大数据时代的到来，保存和使用高质量的样本，以及充足的样本量供下游应用至关重要。如何实现充分利用样本的目标，对研究人员来说仍然是一个非常大的挑战。在医学研究中，人类血液样本经常被用来提取 RNA，包括来自白膜层的总 RNA 和游离的 RNA。Liu 等[12]研究比较冰冻前 RNA 提取的五种不同血液处理方法，并评估从这些方法得到的 RNA 质量和数量。如方案 A，为充分利用血液样本，首先从全血中分离白膜层提取 RNA，其他组分如血浆和红细胞可以直接使用或者留存备用。方案 B（TRIzol）和方案 D（TRIzol LS）用全血分离 RNA，TRIzol 和 TRIzol LS 都是苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液，一步法分离 RNA，其也能用于样本的保存。RNAlater（方案 C）是一种水溶性的、无毒的组织保存剂，非冰冻情况下，稳定或保护细胞的原位 RNA，它也能用于处理和保存白细胞，包括短期储存或室温运输和 –80 ℃ 长期保存。PAXgene Blood RNA tube（方案 F）是一种血液采集管，自采血伊始就稳定细胞内的 RNA。一些研究人员选择在血液样本中不加任何添加剂（如稳定剂）而 –80 ℃ 直接保存，其目的是为了排除在长期保存中添加剂可能产生毒性，以及对未来的实验可能产生的干扰。

在 Häntzsch 等[13]进行的研究中，研究对象是 Leipzig in the LIFE Heart substudy 的队列研究，招募的是心肌梗死（AMI）患者。用 3 个 PAXgene和 3 个 Tempus 血液RNA 采集管，收集 LIFE study 中心的 12 个 AMI 患者和35 个正常人，用 4 种手工法和 2 种半自动法提取 RNA，然后再测定 RNA 的数量和质量。

2 RNA 提取方法的结果汇总

在 Liu 等[12]的研究中，RNA 纯度用 NanoDrop （Thermo Scientific，ND-8000）测定，RNA 浓度和完整性用 Agilent 2100 bioanalyzer（Agilent Technologies，G2939A）及相关软件计算，评估分离的 RNA 产量、纯度和完整性（表 2），用于比较和验证 6 种不同 RNA 处理方法的效能[12]。

表 2 RNA 质量控制结果（±s ）

表 2 RNA 质量控制结果（±s ）

R N A 纯度 R N A 完整性方案 预处理方法 R N A 提取方法 R N A 产量（μ g / m l ） A260/280 A260/230 R I N 值 2 8 S / 1 8 S A B u f f y c o a t -T R I z o l 方法 T R I z o l 试剂一步法 3 . 5 0 ± 0 . 3 2 1 . 9 9 ± 0 . 0 1 1 . 3 5 ± 0 . 1 6 8 . 2 0 ± 0 . 1 6 1 . 4 4 ± 0 . 0 7 B 全血-T R I z o l 方法 3 . 2 9 ± 0 . 3 0 1 . 9 9 ± 0 . 0 1 1 . 4 0 ± 0 . 1 2 8 . 0 1 ± 0 . 1 6 1 . 5 5 ± 0 . 0 7 C 全血-R N A l a t e r 方法 2 . 3 3 ± 0 . 3 3 1 . 9 5 ± 0 . 0 2 1 . 1 0 ± 0 . 1 6 8 . 0 1 ± 0 . 1 4 1 . 1 4 ± 0 . 0 5 D 全血-T R I z o l L S 方法 T R I z o l L S 试剂一步法 9 . 6 8 ± 0 . 7 9 1 . 9 5 ± 0 . 0 1 1 . 3 0 ± 0 . 0 6 7 . 7 5 ± 0 . 1 1 1 . 3 1 ± 0 . 1 9 E 冷冻法 1 4 . 2 9 ± 1 . 5 4 1 . 9 3 ± 0 . 0 1 1 . 2 6 ± 0 . 0 8 5 . 2 9 ± 0 . 4 4 0 . 7 5 ± 0 . 1 4 F P A X g e n e 全血 R N A t u b e P A X g e n e 全血 R N A 试剂盒 5 . 1 0 ± 0 . 7 0 2 . 0 5 ± 0 . 0 1 1 . 3 0 ± 0 . 1 6 7 . 7 6 ± 0 . 1 0 1 . 4 1 ± 0 . 1 0

在 Liu 等[12]进行的研究中，用 6 种不同的处理方法分别提取 11 个样品的 RNA，然后测定平均产量，结果见表 2。TRIzol LS 法、PAXgene 和冷冻法（–80 ℃）直接保存，这 3 种方法得到的 RNA 产量最高。A260/A280比值和A260/A230比值反映 RNA 的纯度。一般来说，A260/A280比值1.8 ～ 2.0 和 A260/A230比值 ≥ 2 被认为是高纯度的样本。6 种方法的 A260/A280比值之间无显著差别，均能得到最适A260/A280比值。然而，所有方法的 A260/A230比值均低于1.5，这可能是由 TRIzol/TRIzol LS 试剂中高浓度的盐/苯酚引起的。最后，用核糖体 28S/18S 比值和 RIN 值评估RNA 的完整性。最适 28S/18S 比值 1.0 ～ 2.0，如果比值大于 2.0 或小于 1.0，表明存在基因组 DNA 或 RNA 降解。在本文中，除了直接 –80 ℃ 保存的样本 28S/18S 比值 ＜ 1.0，其余的 5 种方法均在范围内。除了 –80 ℃ 冷冻直接保存的样本，其余方法得到的 RIN 值均大于 7.0。

在 Liu 等[12]的研究中，方案 A 从白膜层中分离 RNA可以获得最高质量的 RNA（高完整性和高纯度），还能充分利用血液样本；TRIzol LS pretreatment specimens（方案D）获得最高产量 RNA（除了方案 E），质量也较满意，此方法简化了样本的前处理过程，但是全血样本只能用于RNA 提取；用 TRIzol（方案 B）从全血中分离 RNA，得到的 RNA 质量较高，成本也低于 TRIzol LS，但是 RNA数量较低；PAXgene Blood RNA 试剂盒（方案 F）是在无法及时处理血液样本时的良好选择，此方法适用于室温条件下短时间运输，但是仅用作 RNA 提取，成本较高；添加RNAlater 的全血样本可以得到高质量的 RNA，该法的潜在优点尚待研究。

有资料显示，RNA 可用于高要求的基因芯片分析（RIN ＞ 7.0），也能用于定量 PCR 和基因表达谱研究（RIN 4 ～ 7）。因此，上述研究中分离到的 RNA 符合大多数实验的要求。方案 A 中，首先分离血浆和白膜层，其得到的 RNA 的RIN 值最高（7.30 ～ 9.00），血浆还能用于后续的实验。方案 B、C、D、F 均得到高度完整的 RNA，只是方案 C 在处理过程中加了 RNAlater 用于稳定 RNA，需要额外的步骤除去溶液中的 RNAlater，这些步骤可能会导致 RNA 流失，使得 RNA 的产量偏低（1.43 ～ 4.38）。在方案 D（TRIzol LS）和 E（–80 ℃ 直接保存）中，从全血中直接分离 RNA，可能包括游离的 RNA，因此其产量较高，后者得到的 RNA完整性较差（RIN 5.29）。

在 Häntzsch 等[13]进行的研究中，Norgen Kit I with Tempus Tubes 得到的 RNA 收益率最高，Norgen Kit II with PAXgene 最低。疾病状态是 RNA 收益率的次要决定因素（LIFE-AMI 11.2 vs. LIFE 6.7 mg，P ＜ 0.001），首要决定因素是血液采集管。血液采集管和 RNA 分离试剂盒并不影响mRNA 表达，而是 RT/qPCR 试剂导致 mRNA 损耗，但是Norgen Kit II 除外。对于 miRNAs，某些基因的表达差异与采集管有关（miR30b），RNA 分离（Norgen Kit II）和 RT/qRT试剂（miR133a）有关。在 RNA 收益率方面，各种提取试剂盒显著不同，它们影响 miRNA 的表达谱，但是不影响mRNA 的质量。

3 讨论与结语

RNA 提取以溶剂法为基础，从各种样本中快速、有效地提取 RNA。简单而言，用亚硫氢胍及巯基乙醇制备组织匀浆，使内源的 RNA 酶失活，N-月桂肌氨酸将核蛋白复合物变性，再用酸平衡的苯酚：氯仿：异戊醇抽提，使 RNA脱离 DNA 及蛋白质，从混合液中层析到水相，最后用异丙醇沉淀浓缩 RNA。收益率受多个因素的影响，包括组织来源及细胞数量，可通过光吸收测定（A260）来定量 RNA 的浓度。

TRIzol 既是 RNA 的释放剂，又是 RNA 的保护剂。在 TRIzol 中，RNA 是隔离在 RNA 酶污染之外的，对样本的后续操作要求用无 RNA 酶的玻璃器皿。提取 RNA时须注意污染情况，以及尽量少用移液枪抽吸，以免破坏RNA 结构。实验过程要在生物安全柜内进行，避免 RNA酶的污染，操作速度要快，因为提取过程中 RNA 会降解。实验全程佩戴一次性手套和口罩，手套需勤换。

RNA 可以从各种组织中提取出来[16]，不过各种组织的RNA 预期产量有差别。材料用量的上限不得超过 1 g，从少量样本中提取 RNA 时可加入少许糖原以促进 RNA 沉淀，糖原浓度不得过高（＜ 4 mg/ml），否则影响第一链的合成和 PCR 反应。TRIzol 匀浆后加氯仿之前样本可以在 –60 ～ –70 ℃ 保存至少 1 个月，RNA 沉淀在 75% 酒精中 2 ～ 8 ℃ 保存一星期以上或 –20 ℃ 一年以上[17]。提取的 RNA 立即用于逆转录，或保存于 –70 ℃ 超低温冰箱中备用。

RNA 提取系统中各种试剂的作用：①变性剂如 N-月桂肌氨酸、巯基乙醇和亚硫氢胍，可变性细胞内及核蛋白复合物，释放 RNA，这些试剂还能有效抑制核酸酶。②苯酚/氯仿/异戊醇：酸平衡的苯酚/氯仿/异戊醇可抽提去除杂物，使 DNA 及蛋白质沉淀到有机相，而 RNA 留在水相，用酸性的有机溶剂抽提可免去用氯化锂选择沉淀 RNA 的过程。③乙酸钠：具有维持变性的细胞裂解液 pH 值以及沉淀 RNA 的作用。④异丙醇：沉淀浓缩水相中的 RNA。异硫氰酸胍被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂，它在裂解组织细胞的同时也使 RNA 酶失活，它既可破坏组织细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对 RNA 酶有强烈的变性作用。就变性剂的选择来说，CTAB（CTAB 法）比异硫氰酸胍（TRIzol 试剂法）和 SDS（改良热硼酸法）更有效；就CTAB 法来说，由于以 CTAB 为变性剂，同时加入 PVP 和β-巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制 RNase 的活性，使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等，然后再选择性地分离 RNA。所以 CTAB 法不失为一种很好的 RNA 提取方法。

本文系统地阐述了各种 RNA 的提取方法，供批量RNA 提取时参考。同时，RNA 的质量评估通常只关注产量、RIN 值、18S/28S、A260/280比值、A260/230比值等常规项目，由于生物样本库的样本大多数是用于新项目研究，上述指标合格也不能保证适用于所有的新项目分析，因此有些研究人员反对用生物标志物来评估样本的质量[18-20]。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.017

200090 上海，同济大学附属杨浦医院（上海市杨浦区中心医院）科研管理部（章佳英、嵇承栋、万悦竹、付强强）；200090 上海市五角场镇社区卫生服务中心（朱琳懿）

嵇承栋，Email：15800397667@163.com

2016-08-16