补阳还五汤对EAE小鼠免疫调节的作用①

王晓庆 田倩倩 李艳花 刘建春 刘春云 杨春彦 肖保国 尉杰忠 马存根

(山西中医学院“2011”协同创新中心/神经生物学研究中心,太原030024)

·中医中药与免疫·

补阳还五汤对EAE小鼠免疫调节的作用①

王晓庆 田倩倩 李艳花②刘建春 刘春云②杨春彦 肖保国③尉杰忠②马存根

(山西中医学院“2011”协同创新中心/神经生物学研究中心,太原030024)

目的：探讨补阳还五汤对实验性自身免疫性脑脊髓炎的抗炎治疗效果和免疫调节机制。方法：雌性C57BL/6小鼠采用MOG35-55多肽诱导建立EAE模型后，随机分为生理盐水组、补阳还五汤组，每组13只。造模的第3天给药，生理盐水组给予生理盐水25 ml/kg灌胃，补阳还五汤组给予补阳还五汤生药量50 g/kg灌胃，共治疗25 d。每天记录临床症状评分和体重变化。HE染色检测脊髓组织炎细胞浸润，髓鞘染色观察髓鞘脱失情况，免疫荧光技术检测脾脏ROCKⅡ表达。流式细胞术检测脾脏CD4+T细胞亚群变化。Western blot法检测脊髓TLR4、Myd88、NF-κB、COX-2、ROCKⅡ和脑ROCKⅡ的表达。结果：与生理盐水组比较，补阳还五汤治疗后明显降低EAE小鼠神经功能评分(P<0.001)，抑制中枢神经系统炎细胞浸润(P<0.05)，减轻髓鞘脱失(P<0.05)，增加CD25+(P<0.05)、IL-10+(P<0.05)、TGF-β+(P<0.01)、IFN-γ+(P<0.05)CD4+T细胞的比例；抑制外周和中枢ROCKⅡ的表达(P<0.05)；减少脊髓TLR4、Myd88、NF-κB、COX-2的表达(P<0.05)。结论：补阳还五汤可以通过抑制ROCKⅡ/TLR4/ NF-κB炎性通路和调节外周T细胞亚群比例发挥其抗炎和免疫调节作用。

补阳还五汤；实验性自身免疫性脑脊髓炎；ROCKⅡ/TLR4/NF-κB炎性通路

多发性硬化(Multiple sclerosis ,MS)是发生于中枢神经系统的CD4+T细胞介导的炎性自身免疫性疾病，以神经髓鞘的脱失、多病灶的炎症和轴突退化为病理特点。临床上对MS的治疗多采用免疫抑制剂或激素疗法，病残率较高，预后差，且价格高昂[1]。实验性自身免疫性脑脊髓炎( Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是国际公认的MS实验动物模型[2]。在EAE发病情况下，CD4+T细胞通过血-脑脊液屏障进入CNS，经抗原提呈激活CNS内小胶质细胞，小胶质细胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1等致炎性细胞因子，形成炎性微环境，更多的CD4+T细胞和巨噬细胞进入CNS，放大炎性反应，最终导致神经元的变性死亡[3]。中医学通过对MS的研究探索认为，本虚标实是其基本特征，气虚血瘀证为MS辨证论治中的常见证型，益气活血能明显改善临床症状[4]。补阳还五汤(Buyang Huanwu Decoction，BYHWD)为清代著名医家王清任经典的补气活血方剂，由生黄芪四两、当归尾二钱，赤芍一钱半，川芎一钱，地龙一钱，桃仁一钱，红花一钱组成，具有补气活血通络之功效。研究显示，补阳还五汤或组方中的单药或有效成分具有抗炎抑炎、免疫调节、抗氧化和神经保护等作用[5]。临床研究发现激素合并BYHWD治疗MS能有效缓解病情，减少激素撤减过程中复发的危险性，减少发作次数与发作程度[6]。我们前期的研究也发现BYHWD对离体的致脑炎性T细胞有明显的免疫调节作用，初步证实了其具有治疗EAE的潜能[7]。本研究以EAE小鼠为研究对象，根据中医理论，进一步观察益气活血法的代表方BYHWD对EAE的干预治疗，积极发挥中医药优势，为临床应用益气活血法，有效防治中枢神经系统自身免疫性疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8～10周龄雌性C57BL/6小鼠，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物实验遵照山西大同大学生物医学研究伦理审查委员会制定的实验动物伦理原则执行科学实验)，实验前小鼠在无病原菌动物房清洁级饲养(25℃左右)，自由饮食喂养1周。

1.1.2 药物及试剂 补阳还五汤方剂由黄芪120 g，当归6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龙3 g，红花3 g，桃仁3 g 等7味药组成，购自太原同仁堂药店，由山西中医学院段秀俊老师鉴定药物合格。药物按常规方法，用自来水煎煮2次，混匀后用双层纱布过滤，收集滤液，文火煎煮浓缩成生药2 g/ml，室温冷却后，于4℃冰箱内保存备用，临用前充分摇匀，并且加热至37℃。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35～55多肽(Myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55peptide，MOG35-55)(纯度98.39%，批号：9001)购自上海强耀生物科技有限公司；结核分枝杆菌(M.TUBERCULOSIS H37 RA)(批号：231141)购自美国DIFCO公司；完全弗氏佐剂(Complete Freund,s Adjuvant)(批号：60103)购自美国Sigma 公司；细胞流式相关抗体FITC Rat Anti-mouseCD4(批号：553729)、PE-TGF-β(批号：563143)购自美国BD公司；PE-CD25(批号：12-0251-82)、PE-IL-10(批号：12-7101-81)购自美国eBioscience公司；PE-IFN-γ(批号：505808)、PE-IL-17A(批号：506904)购自美国Biolegend 公司；Western blot 相关抗体Toll-like Receptor 4(批号：2219S)购自美国Cell Signaling 公司；Myd88(批号：ab2064)、p-NF-κB/p65(批号：ab86299)、COX-2(批号：ab62331)、ROCKⅡ(批号ab125025)购自英国abcam公司；bete-actin(批号：4970S)、GAPDH(批号：4970S)购自美国Cell Signaling 公司；二抗HEP-goat anti-mouse IgG(批号：E030110-1)、HEP-goat anti-rabbit IgG(批号：E030120-1)购自美国Pierce公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒，BCA 试剂(A、 B)、蛋白标准配制液、RIPA 裂解液、PMSF(批号：P0010)购自中国Beyotime Biotechnology 公司。

1.1.3 仪器 凝胶成像分析仪(Bio-Rad，型号：Universal HoodⅡ)，荧光显微镜(Olympus，型号：BX51)，冰冻切片机(Leica，型号：CM1950)，流式细胞仪(BD Biosciences，型号：BD FACSCaliburTMFlow Cytometer 342976) 。

1.2 方法

1.2.1 分组 26只雌性C57BL/6小鼠，随机分为生理盐水组(Saline)和BYHWD组，每组13只。

1.2.2 EAE模型制备[8]用生理盐水溶解配制MOG35-55,加用TB和完全弗氏佐剂,使油剂和水剂体积比为1∶1。用注射器反复推抽，形成抗原乳剂。生理盐水组和BYHWD组小鼠按0.1 ml/只于背部皮下4个点分别注射抗原乳剂(MOG35-55浓度为250 μg/只,TB浓度为350 μg/只),在免疫当日和48 h后，各组每只小鼠分别腹腔注射PTX，每次300 ng。

1.2.3 BYHWD干预 免疫后第3天给药，生理盐水组给予生理盐水25 ml/kg灌胃，补阳还五汤组给予补阳还五汤生药量50 g/kg(生药2 g)灌胃，每组取8只动物于发病高峰期(免疫后第17天)处死。每组剩余5只动物持续给药至疾病缓解期(免疫后28 d)。

1.2.4 神经功能评分 免疫后第1天起，每日对小鼠进行神经功能评分。评分标准参考国际通用的5分法进行临床症状评分，症状介于两者评分之间者以±0.5分计[9]：①0分：无任何临床症状；②1分：尾部张力消失，可见轻度步态笨拙；③2分：一侧后下肢无力，被动翻身后可以恢复；④3分：双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动；⑤4分：双侧后肢瘫痪伴前肢瘫痪；⑥5分：濒死状态或死亡。累积临床评分[10]为每组每只小鼠自发病当日起(疾病评分≥1)至实验结束评分的总和。累积疾病指数[11]为组内每只小鼠每天临床评分总和的均数。

1.2.5 标本采集 免疫后17 d，采用0.3%戊巴比妥钠0.2 ml/只腹腔麻醉，各组4只取脾脏制备成单个核细胞悬液；用生理盐水心脏灌注至肝脏发白，同时动物快速冰上解剖脊髓和脑组织，匀浆后提取蛋白，定量后采用Western blot技术检测TLR4、Myd88、NF-κB、COX-2、ROCKⅡ。各组其余4只动物用4%多聚甲醛灌流进行体内组织固定，然后分离脊髓、脑和脾脏，OCT(Optimum cutting temperature)包埋剂包埋，于液氮中冷冻，做厚度为10 μm的冰冻切片，进行髓鞘、HE染色及免疫荧光染色。

1.2.6 HE染色和髓鞘染色 取脊髓切片水中浸泡2 min，苏木精染色4 min，快速水洗，0.5%盐酸乙醇分化15 s，0.5%伊红30 s，快速水洗，梯度乙醇脱水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性树胶封片，光镜下观察。取脊髓切片于95%乙醇中浸泡15 min，浸于勒克司坚牢蓝(Luxol fast blue，LFB)染液中，57℃孵育24 h，于95%乙醇溶液浸洗10 min，去离子水浸洗5 min，0.05%碳酸锂快速浸洗10 s，70%乙醇分化至灰质与白质能够清晰辨别，去离子水浸洗5 min，梯度乙醇脱水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性树胶封片，光镜下观察。

1.2.7 免疫荧光染色 脾脏的冰冻切片室温干燥,经PBS洗5 min×3次；1%BSA室温封闭1 h后， 将抗小鼠Rock单克隆抗体按1∶500比例加入含BSA(10 g/L)、TritonX-100(3 ml/L)的稀释液中，将含有抗体的稀释液均匀滴在脾脏的冰冻切片上，置4 ℃过夜。次日PBS 洗5 min × 3 次，荧光素标记抗小鼠IgG(1∶1 000)标记，室温孵育2 h,PBS洗5 min×3次,最后50%甘油封片荧光显微镜镜检。

1.2.8 Western blot 用组织裂解液在4℃条件下充分裂解脊髓和脑组织蛋白，并用BCA法测定蛋白含量。制备蛋白上样缓冲液样品，用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。电泳完毕后，将分离好的蛋白凝胶用湿式转移法转移到硝酸纤维(PVDF)膜(稳流220 mA，2 h)，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入TLR4、Myd88、NF-κB、COX-2、ROCKⅡ抗体(1∶1 000)β-actin、GAPDH抗体(1∶10 000)，4℃过夜；次日洗涤后孵育相对应的HRP耦联二抗(1∶10 000)室温2 h。洗膜后，进行化学发光反应，用Bio-RAD凝胶成像分析仪检测条带，Image Lab(3.0) 软件进行灰度值比较，并进行统计学分析。

1.2.9 流式细胞术检测 单个核细胞悬于50 μl 0.1% 皂甙/1% BSA-PBS破膜剂中，分别加1 μl流式抗体，包括FITC-CD4，PE-IL-10，PE-CD25，PE-IFN-γ和PE-TGF-β抗体，室温避光20 min。PBS洗10 min，共2次，加500 μl PBS，流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)检测。

2 结果

2.1 BYHWD推迟EAE发病时间和减轻临床症状 小鼠于免疫后第10天开始陆续发病，生理盐水组小鼠发病率为100%。BYHWD组发病率为76%。严重发病死亡率为0。生理盐水组的平均起病时间为(10.46±2.18) d、平均最高评分为(3.62 ± 0.46) 分、累计临床评分为(36.58± 8.63)分、累积疾病指数为(1.13±0.86)；BYHWD治疗组平均起病时间为(16.6±2.32) d、平均最高临床评分为(1.19 ± 0.8)分，累计临床评分为(3.96± 5.35)分、累积疾病指数为(0.25±0.28)；与生理盐水组比较，BYHWD推迟了发病时间，降低了临床评分(图1A)，差异有统计学意义(P<0.001)。两组小鼠的体重变化结果显示生理盐水组随着临床症状加重,体重减轻明显(图1B)；BYHWD组在临床症状改善的同时体重减轻较少(P<0.001)。2.2 BYHWD抑制脊髓炎性细胞浸润 HE染色显示，生理盐水组小鼠脊髓白质区大量炎性细胞浸润，以腰膨大处炎性细胞浸润最为明显，而BYHWD组明显较少。用Image-Pro Plus 软件统计，生理盐水组白质区占白质比值为(9.95±5.36)%，BYHWD组为(2.25±1.29)%，两组比较有统计学意义(P<0.05，图2)。

2.3 BYHWD可减少脊髓的髓鞘脱失面积 LFB染色显示，生理盐水组脊髓白质出现大面积髓鞘脱失，而BYHWD组髓鞘脱失面积较少(图3A) 。生理盐水组髓鞘脱失与白质面积比值为(27.69±8.44)%，BYHWD组为(8.28±3.02)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，图3B)。

2.4 BYHWD抑制ROCKⅡ在脊髓、脑和脾脏中的表达 免疫荧光染色检测脾脏中ROCKⅡ的表达，(图4A)，同时用Western blot法检测脊髓和脑中ROCKⅡ的表达(图4B)，结果显示，生理盐水组ROCKⅡ在脾脏、脑和脊髓中高表达，BYHWD治疗后，抑制了ROCKⅡ的表达(P<0.05)。

图1 两组临床评分和体重变化的比较Fig.1 Clinical scoring and weight change of two groupsNote: *.P<0.05；**.P<0.01;***.P<0.001 vs the saline group.

图2 免疫后第17天脊髓HE染色Fig.2 HE staining of spinal cord at day 17 after immunizationNote: *.P<0.05 vs the saline group.

图3 免疫后第17天脊髓LFB染色Fig.3 LFB staining of spinal cord at day 17 after immunizationNote: *.P<0.05 vs the saline group.

2.5 BYHWD调节单个核细胞的T细胞表达 无菌操作筛选脾脏单个核细胞，通过流式细胞术观察BYHWD对T细胞亚型变化的影响。结果显示：BYHWD 可明显增强CD25+、IL-10+、TGF-β+、IFN-γ+的CD4+T细胞的表达(P<0.05，图5)。

图4 免疫后第17天脾脏、脊髓和脑中ROCKⅡ的表达Fig.4 Expression of ROCKⅡ in spleen，spinal cord and brain at day 17 after immunizationNote: *.P<0.05 vs the saline group.

图5 BYHWD调节CD4+T细胞比例Fig.5 BYHWD regulated polarization of CD4+ T cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01 vs the saline group.

图6 免疫后第17天BYHWD对炎性通路的影响Fig.6 Effect of inflammatory pathway of BYHWD at day 17 after immunizationNote: *.P<0.05 vs the saline group.

2.6 BYHWD抑制炎性信号通路的激活 Western blot法检测BYHWD对TLR4炎性信号通路的影响。结果显示，生理盐水组TLR4、Myd88、 p-NF-κB/p65、COX-2均为高表达，而BYHWD组脊髓中TLR4、Myd88、p-NF-κB/p65、COX-2表达得到明显抑制(P<0.05，图6)。结果表明，BYHWD可以抑制TLR4信号通路的激活发挥抗炎作用。

3 讨论

多数研究已证实，MS/EAE的发病是一种由T细胞介导的、起源于外周的免疫应答，继而有活化的外周免疫细胞侵入CNS并在局部扩增，在CNS促发局部炎症反应，引发相应的临床症状[12]。Rho/ROCK是机体普遍存在的一条信号转导通路，伴随多种炎症介质和细胞因子受体后耦联的活化而激活，通过激酶级联反应介导和调控细胞的增殖、分化和移行等，是细胞行为改变最直接的信号分子。近年来的研究显示，ROCK信号通路及炎性信号TLR4/ NF-κB在MS/EAE的发生发展过程中起着重要作用[13]。ROCK激活是T淋巴细胞活化和迁移所必需的条件，抑制ROCK通路能更好地抑制外周免疫细胞活化和增殖，有效阻止向CNS的移行。抑制TLR4信号转导途径或MyD88基因敲除阻断TLR4的MyD88依赖信号转导，对EAE发生均有一定抑制作用[14，15]。本研究用益气活血的代表方剂BYHWD在EAE早期(免疫后第3天)给予干预治疗，取发病高峰期(免疫后第17天)的组织进行研究，结果证实BYHWD使EAE的发病率明显下降，平均高峰期临床症状评分下降，有效缓解了EAE的发病和临床症状。病理结果也表明，BYHWD明显减轻EAE外周炎性细胞向CNS的浸润，明显降低外周和中枢ROCKⅡ的表达，抑制脊髓中TLR4、Myd88、p-NF-κB/p65、COX-2表达。由此推测BYHWD通过抑制ROCKⅡ在中枢表达，抑制TLR4、MyD88的表达，从而抑制MyD88信号转导途径对NF-κB激活，从而发挥对EAE的治疗作用。

免疫细胞主要有CD4+Th1、Th2细胞和调节性T细胞等[16]。CD4+Th1细胞被认为是致炎性细胞，而Th2细胞和调节性T细胞具有抗炎作用。在EAE病理情况下，免疫系统的多种成分发生了复杂的变化。体内实验证实，通过抑制EAE小鼠炎症反应，抑制CD4+Th1细胞释放IFN-γ炎性因子，促进Th2细胞释放免疫抑制因子，改变Th1细胞和Th2细胞的比例，可改善EAE小鼠的临床症状，达到很好的治疗效果[17，18]。本实验的流式细胞术检测显示BYHWD能显著增加IL-10+、TGF-β+和CD25+的CD4+T细胞的比例。

一般认为IFN-γ是炎性细胞因子，可以刺激小胶质细胞激活，产生NO和其他炎性细胞因子[19]。本实验中BYHWD可增加脾脏单个核细胞IFN-γ+CD4+T 细胞的百分比，提示BYHWD和其他免疫抑制剂之间可能存在不同的作用机制。IFN-γ对EAE也可能具有免疫保护作用。有研究显示，IFN-γ 缺陷小鼠，Th17 细胞的数量和细胞分泌会增加，体外给予 IFN-γ 可以使 EAE 小鼠体内 Th17 细胞的数量降低，并且抑制其功能[20]。

MS/EAE病因和发病机制复杂，治疗仍缺乏特异性和有效性。中医药以多靶点、多途径，整体调节、协同作用强、毒副作用小的特点在延缓MS疾病进程方面有着西药不可比拟的优势。祖国医学通过研究探索认为，MS/EAE归属于中医的“痿证”、“眩晕”、“视谵昏渺”等范畴。病机特点为气血亏虚致筋脉失养，或兼外邪乘虚侵袭，而成痰、湿、瘀，阻滞经络，属本虚标实证。针对病机，治疗法则应以补气、活血、祛痰、湿、瘀、通络为主。补阳还五汤出自清代著名医家王清任《医林改错》,原书称此汤专治“因虚致瘀”之证，因气血亏虚、经络瘀阻而致诸症。 方中重用生黄芪为君药，大补元气，使气旺以促血行，祛瘀而不伤正，并助诸药之力；当归尾为臣药，长于活血补血，且化淤而不伤血；川芎、赤芍、红花，桃仁均为佐药，助当归尾活血祛瘀，地龙则有通经活络之功。诸药性味平缓、补而不滞、祛邪不伤正，使气虚得补，气旺则血行，瘀祛则络通，血脉通利。

本实验研究表明，BYHWD以50g/kg为有效剂量，可缓解EAE临床症状、减少髓鞘脱失，抑制炎细胞浸润、增加CD25+、IL-10+、TGFβ+、IFN-γ+的CD4+T细胞的比例；抑制ROCKⅡ的表达；减少脊髓TLR4、Myd88、p-NF-κB/p65、COX-2的表达。这些作用可能是通过抑制ROCKⅡ/TLR4/ NF-κB炎性通路和调节外周CD4+T细胞亚群比例发挥其抗炎和调节免疫作用，从而减轻EAE的发病程度。

由此可见，补阳还五汤可以通过补气、活血、祛瘀、通络，从抗炎抑炎、免疫调节等多重途径对MS进行干预，有望为临床治疗MS提供一种安全、有效且不良反应少的可靠疗法。补阳还五汤所显示的益气活血法可作为MS“标本兼治”的通用性中医治则之一。

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[收稿2016-06-14 修回2016-09-21]

(编辑 许四平)

Immunoregulatory effect of BuyangHuanwu Decoction on experimental autoimmune encephalomyelitis mice

WANGXiao-Qing,TIANQian-Qian,LIYan-Hua,LIUJian-Chun,LIUChun-Yun,YANGChun-Yan,XIAOBao-Guo,YUJie-Zhong,MACun-Gen.

"2011"CollaborativeInnovationCenter/ResearchCenterofNeurobiology,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Taiyuan030024，China

Objective:To explore the anti-inflammatory therapeutic effect and possible immunoregulatory mechanism of Buyang Huanwu Decoction (BYHWD) on the development of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).Methods: Female C57BL/6 mice were immunized subcutaneously with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides (MOG35-55),and randomly divided into saline group,BYHWD group,with 13 mice in each group.At the 3th day,25 ml/kg of saline was orally given to each mouse of saline group,50 g/kg ig of crude BYHWD was orally given to each mouse in BYHWD group for 25 days.Clinical score and body mass were recorded every day.Inflammatory cell infiltrations of spinal cord were observed by HE staining Myelin staining observes the demyelination situation.And the expression of ROCKⅡ in spleen was detected by immunofluorescence staining.The subtypes of CD4+T cells were analyzed by flow cytometry.Western blot was used to detect the expression of TLR4，Myd88，NF-κB，COX-2，ROCKⅡ in spinal cord and ROCKⅡ in brain.Results: The neurologicalscore significantly decreased in EAE mouse of BYHWD group compared with the saline group(P<0.001) .BYHWD inhibited the inflammatory cell infiltration and demyelination in the nervous centralis(P<0.05).The treatment of BYHWD effectively reduced the increased the proportion of CD25+(P<0.05)，IL-10+(P<0.05)，TGF-β+(P<0.01)，IFN-γ+(P<0.05)CD4+T cells ,and inhibited the expression of peripheral and central ROCKⅡ(P<0.05) ;BYHWD reduced the expression of TLR4,MyD88,NF-κB,COX-2 in spinal cord (P<0.05).Conclusion: BYHWD can exert anti-inflammatory and immune regulation effect by the inhibition of ROCKⅡ/TLR4/ NF-κB signaling pathway and regulation of the proportion of peripheral T cell subsets.

Buyang Huanwu Decoction;Experimental autoimmune encephalomyelitis;ROCKⅡ/TLR4/NF-κB signaling pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.010

①本文为国家自然科学基金2014年面上项目(81473577)、山西省自然科学基金(2013011052-4)、山西省国际科技合作项目(2013081058)、山西省回国留学人员重点科研资助项目(2014-重点7)和山西中医学院“2011”培育计划项目(2011PY-1)。

王晓庆(1989年-)，女，在读硕士，主要从事中医内科脑病研究，E-mail:1109957988@qq.com。

及指导教师：尉杰忠(1975年-)，男，在读博士，副教授，硕士生导师，主要从事神经免疫学研究，E-mail:sxdtyjz@qq.com。 马存根(1960年-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事神经免疫学研究， E-mail:macungen2001@163.com。

R285

A

1000-484X(2017)01-0052-06

②山西大同大学脑科学研究所，大同037009。

③复旦大学附属华山医院神经病学研究所，上海200025。