miR-132靶向调控Ezrin抑制卵巢癌细胞增殖、促进凋亡的实验研究

杨 波 李胜泽 马 玲 郭苏阳 刘红丽 刘 健 邵均均

(蚌埠医学院第一附属医院妇瘤科，蚌埠233004)

miR-132靶向调控Ezrin抑制卵巢癌细胞增殖、促进凋亡的实验研究

杨 波 李胜泽 马 玲 郭苏阳 刘红丽 刘 健 邵均均

(蚌埠医学院第一附属医院妇瘤科，蚌埠233004)

目的：探讨微小核糖核酸分子(miRNA)-132在卵巢癌中生物学作用和作用靶点。方法：收集22例卵巢癌及癌旁非肿瘤组织标本，RT-PCR检测miR-132表达量；RT-PCR检测人正常卵巢上皮细胞和卵巢癌细胞系中miR-132表达量；选择miR-132表达量最高或最低的卵巢癌细胞株，分别转染阴性对照质粒(NC)和miR-132 mimic质粒，RT-PCR检测转染后miR-132表达量；CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western blot检测Ezrin蛋白表达。结果：卵巢癌组织中miR-132表达量显著低于癌旁非肿瘤组织，而卵巢癌细胞系中miR-132表达量显著低于正常卵巢上皮细胞，差异均有统计学意义(P<0.05)；选择卵巢癌细胞株中miR-132表达量最低卵巢癌SKOV3细胞株进行基因转染，与转染阴性对照质粒相比，转染miR-132 mimic质粒后miR-132表达量显著上升，细胞增殖显著降低，细胞凋亡显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；Western blot结果显示，上调miR-132表达后，卵巢癌SKOV3细胞株中Ezrin蛋白表达显著上升(P<0.05)。结论：在卵巢癌中，miR-132可能作为一种抑癌基因通过靶向调控Ezrin抑制卵巢癌细胞增殖、促进凋亡。

miR-132；卵巢癌；增殖；凋亡；埃兹蛋白

卵巢癌在妇科肿瘤中发病率排第三，病死率第一。卵巢癌病死率居高不下的原因是由于早期筛查和诊断困难，患者就诊时大部分已经处于中晚期，加上卵巢癌对化疗的耐药以及复发和转移[1]。而提高卵巢癌的早期诊断和有效治疗方法是目前临床亟待解决的问题。

埃兹蛋白(Ezrin) 是ERM家族成员之一，是一种膜细胞骨架连接蛋白，能够对细胞的形态、黏附和运动造成影响。Ezrin能够将转移信号转导致细胞内，在细胞信号转导方面具有重要作用[2]。Ezrin主要表达与上皮细胞膜的内侧，在大多数的组织中均有表达，具有广泛的生理功能。Ezrin能够调节肿瘤细胞表明的黏附分子，对肿瘤细胞的生长、分化等具有重要的调节作用[3]。研究认为，Ezrin低表达与卵巢癌的恶性程度、复发和转移、预后等密切相关[4，5]。

染色体重塑、组蛋白修饰、DNA甲基化以及非编码RNA调控等表观遗传学方面是近年来肿瘤发病机制研究的重点。其中非编码RNA调控作为一种新颖的基因表达调控机制备受关注。微小核糖核酸分子(MicroRNA)是常见的非编码单链RNA，广泛参与了基因网络调控，在炎症发生，细胞生长、分化、增殖、凋亡，肿瘤发生，组织器官形成和信号通路调控中扮演着重要的角色。研究已经证实，多种肿瘤的发生和发展与miRNA密切相关[6-8]。

miR-132定位在人类染色体17p13，与中枢神经系统、肿瘤、炎症、和血管生长密切相关。已经有研究发现，乳腺癌、大肠癌、肝癌、非小细胞肺癌等多种人类肿瘤中miR-132低表达，发挥抑癌基因作用[9-12]。miR-132在卵巢癌中的作用并不明确，本研究旨在探讨miR-132在卵巢癌中生物学作用和作用靶点，以期寻找到有效的卵巢癌诊断标志物和治疗靶点，改善患者预后。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本和细胞系 收集医院2014年8月～2016年2月手术切除的22例卵巢癌及癌旁非肿瘤组织标本，标本获取后30 min内液态氮速冻，并在-80℃条件下保存。所有患者均经病理诊断确诊，术前均未进行放疗或化疗。22例患者中年龄28～62岁，平均年龄(46.65±15.48)岁。人正常卵巢上皮细胞(IOSE80)和卵巢癌细胞系(OVCAR3、A2780、SKOV3、ES2)均购自长沙赢润生物科技有限公司，置于5%CO2、饱和湿度、37℃的胎牛血清培养基中常规培养，稳定传代2～3次后选取对数期生长的细胞进行实验。

1.1.2 试剂和材料 anti-β-actin、anti-Ezrin均由美国Sigma公司提供；电泳仪、PCR仪购自美国Bio-Rad公司，CO2培养箱购自美国Thermo公司；流式细胞仪由美国BECKMANCOULTER公司提供。PCR引物及miR-132类似物(mimic)由上海吉玛生物公司提供；脂质体LipofectamineTM2000、miRNeasy mini Kit试剂盒、RT-PCR试剂盒、TRIzol试剂盒均购自德国Qiagen公司；DMEM培养基、胎牛血清由美国GeneCopoeia公司提供。CCK-8试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自日本Dojindo公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测组织和细胞中miR-132表达 病理组织切2～4薄片约100 mg，室温裂解后加入三氯甲烷，离心后静置，随机选取12个样品，每个样品取2 μl。采用TRIzol试剂盒提取组织样品和细胞中总RNA。制作逆转录反应体系，并合成修饰后的miRNA cDNA。以cDNA作为模板，制作RT-PCR的反应体系，PCR反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 min，扩增40个循环。根据融解曲线计算循环数Ct值，Ct值越小，参与反应的起始模板量越多，以U6作为内参基因，计算△Ct=CtmiR-132-CtU6，miR-132的相对表达量=2-△△Ct。

1.2.2 基因转染 构建慢病毒感染的阴性对照质粒(NC)和miR-132 mimic质粒。用含1%的双抗和5%灭活的胎牛血清培养基培养卵巢癌细胞系(选择其中一种表达量最低或最高的)，细胞起始浓度为2×106个/孔。细胞密度达到75%时将对数期生长的细胞分为两组(NC组和miR-132 mimic)，分别加入NC和miR-132 mimic病毒悬浮液，以新鲜培养基更换旧的培养基。RT-PCR检测转染后miR-132表达量。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖 取NC组和miR-132 mimic组分别转染了24、48、72、96、120 h的对数生长期细胞，胰酶消化后以2×106个/孔加入到96孔板中，常规培养孵育3 h后加入CCK-8溶液10 μl，孵育2 h后酶标仪测定吸光度(OD)值，绘制增殖曲线。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 将转染48 h后的两组细胞用PBS清洗，胰酶消化后制成细胞悬液，离心弃上清液，PBS清洗后加入Binding buffer清洗和重悬细胞，加入碘化丙啶和Annexin V-FITC，孵育20 min制成1×105个/ml的细胞悬液，尼龙网过滤后上流式细胞仪测定。

1.2.5 Western blot检测Ezrin蛋白表达 按照试剂盒说明提取细胞中的总蛋白，变性。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，酶标仪测定OD值，绘制标准曲线。配置与蛋白大小相符的分离胶和浓缩胶，蛋白上样后浓缩胶电泳加压。脱脂奶粉封闭，加入1∶1 000稀释的Ezrin和1∶5 000稀释的β-actin一抗；孵育1 h后加入1∶5 000通用二抗。孵育0.5 h后漂洗、显影、曝光，图像处理软件分析Ezrin蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 卵巢癌组织和细胞中miR-132表达量 与癌旁组织比较(0.993±0.054)相比，22例卵巢癌组织中miR-132表达量(0.503±0.219)显著降低，差异有统计学意义(t=3.302,P<0.05)(图1A)。4种卵巢癌细胞中miR-132表达量均显著低于卵巢正常上皮细胞株IOSE80(P<0.05)，其中SKOV3细胞株中miR-132表达量最低(图1B)，作为后续实验的细胞株。

2.2 转染miR-132 mimic后SKOV3细胞株miR-132表达量上升 采用miR-132 mimic转染SKOV3细胞株，miR-132表达量显著上升(7.749±1.035)，与NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 卵巢癌组织和细胞中miR-132表达量Fig.1 miR-132 expression in ovarian cancer tissue and cell volumeNote: *.P<0.05.

图2 转染miR-132 mimic后SKOV3细胞株miR-132表达量上升Fig.2 Expression of miR-132 increased after transfection miR-132 mimic in SKOV3 cell linesNote: *.P<0.05.

2.3 过表达miR-132对卵巢癌细胞增殖的影响 采用转染miR-132 mimic上调卵巢癌SKOV3细胞株miR-132表达量，CCK-8检测各组细胞增殖情况，结果发现，自72 h开始，miR-132 mimic组细胞增殖显著降低，与NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 过表达miR-132对卵巢癌细胞凋亡的影响 采用转染miR-132 mimic上调卵巢癌SKOV3细胞株miR-132表达量，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，结果发现，miR-132 mimic组细胞凋亡显著增加，与NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图3 过表达miR-132抑制卵巢癌细胞增殖Fig.3 Overexpression of miR-132 inhibits proliferation of ovarian cancer cellNote: *.P<0.05.

图4 过表达miR-132促进卵巢癌细胞凋亡Fig.4 Overexpression of miR-132 promotes apoptosis of ovarian cancer cellNote: *.P<0.05.

图5 过表达miR-132促进卵巢癌细胞中Ezrin蛋白表达Fig.5 Overexpression of miR-132 promotes expression of Ezrin in ovarian cancer cellNote: *.P<0.05.

2.5 Ezrin是miR-132下游靶基因 Western blot结果显示，上调miR-132表达后，卵巢癌SKOV3细胞株中Ezrin蛋白表达显著上升(P<0.05)，推测Ezrin是miR-132下游靶基因。见图5。

3 讨论

卵巢癌是临床常见的妇科生殖系统恶性肿瘤，具有恶性程度高、病死率高以及极易出现复发和转移、预后差等特点。由于缺乏早期特异性症状和有效的筛查方法，卵巢癌早期不易被发现，而多数患者因出现临床症状就诊时已经到了中晚期。手术+化疗等综合治疗方式虽然可以取得一定的效果，但卵巢癌患者的5年生存率仍然不到30%。了解卵巢癌细胞发生发展的分子机制，发掘差异性表达的预测分子标志物并对其生物学功能进行深入研究，将有助于提高卵巢癌诊断和治疗水平，具有重要的临床意义。

miRNA因其新颖的基因表达调控机制近年来备受关注，miRNA不编码蛋白，通过结合下游靶基因3′-UTR影响mRNA。目前关于miRNA与卵巢癌的报道较多，Liu等[13]发现卵巢癌中MiR-214显著降低。Chen等[14]通过对卵巢癌预后的研究发现，miR-21和附睾蛋白4(HE4)均在卵巢癌组织中高表达，两者呈显著正相关，复发患者miR-21和HE4表达量高于未复发患者，认为miR-21和HE4与卵巢癌的预后有关。本研究采用RT-PCR技术，首先检测了22例卵巢癌组织和癌旁非肿瘤组织中miR-132表达量，结果发现卵巢癌组织miR-132表达量显著低于癌旁组织；进一步对比了卵巢癌细胞系和正常卵巢上皮细胞中miR-132表达量，结果发现，卵巢癌细胞系miR-132表达量显著低于正常卵巢上皮细胞。说明miR-132在卵巢癌中低表达，可能作为抑制抑癌基因参与卵巢癌的发生和发展。

增殖增加和凋亡减少是肿瘤细胞最常见的两个生物学特点，也是肿瘤形成和发展的生物学基础[15]。为了研究miR-132在卵巢癌细胞中的生物学作用，本研究采用过表达质粒miR-132 mimic转染卵巢癌细胞SKOV3，结果发现miR-132表达量显著上升；上调miR-132表达后卵巢癌细胞的增殖受到了显著的抑制，凋亡明显增加。结果表明，miR-132有促进肿瘤细胞凋亡，抑制增殖的作用，与Tian等[16]结果类似。

关于miR-132相关分子信号机制存在较大差异，例如Lei等[17]研究发现miR-132通过调控YAP抑制肝癌细胞增殖。在垂体肿瘤的研究中，Ren等[18]发现，miR-132在垂体肿瘤中低表达，上调miR-132表达可以降低Sox5表达并抑制肿瘤细胞生长、侵袭和转移。以往研究认为，Ezrin低表达与卵巢癌的恶性程度、复发和转移、预后等密切相关[4，5]。利用生物信息学检索工具可以发现Ezrin是miR-132下游靶点之一，具有miR-132的特异性结合序列。因此，本研究进一步检测了上调miR-132表达后Ezrin蛋白表达情况，结果发现，Ezrin蛋白表达显著上升。结果表明miR-132可能靶向调控Ezrin抑制卵巢癌细胞增殖、促进凋亡。

总而言之，本研究发现卵巢癌中miR-132低表达，miR-132可能作为一种抑癌基因，靶向调控Ezrin抑制卵巢癌细胞增殖、促进凋亡，为进一步的分子机制研究提供了新的思路。本研究的不足之处主要有：首先临床样本量不足，研究结果可能存在偏倚；此外，本研究为体外细胞研究，体内研究结果仍需要后续开展以进一步验证。

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[收稿2016-08-15 修回2016-10-14]

(编辑 许四平)

Experimental research of miR-132 inhibits proliferation and induces apoptosis of ovarian cancer via Ezrin

YANGBo,LISheng-Ze,MALing,GUOSu-Yang,LIUHong-Li,LIUJian,SHAOJun-Jun.

DepartmentofGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China

Objective:To explore the biological function of miR-132 in ovarian cancer and the target.Methods: 22 cases ovarian cancer tissue and non-tumor tissue adjacent were collected,the expression of miR-132 in tumor tissue and non-tumor tissue,normal ovarian epithelial cells and ovarian cancer cell were detected by RT-PCR.The normal ovarian epithelial cells which the expression of miR-132 maximum or minimum were chosen,and they were divided into two groups,respectively with transfection of negative control plasmid (NC) and miR-132 mimic plasmid.The expression of miR-132 after transfection was detected by RT-PCR,the cell proliferation and cell apoptosis were detected by CCK-8 method and flow cytometry instrument respectively,the expression of Ezrin protein was detected by Western blot.Results: The expression of miR-132 in tumor tissue was significantly lower than the tumor tissue adjacent,the expression of miR-132 in ovarian cancer cell lines was significantly lower than normal ovarian epithelial cells,the differences were statistically significant (P<0.05).The SKOV3 cell lines was chosed for gene transfection,compared with NC group,transfection with miR-132 mimic plasmid could significantly reduce cell proliferation,increase cell apoptosis,the difference had statistical significance (P<0.05).Western blot results showed that up-regulation miR-132 significantly increased the Ezrin protein expression in ovarian cancer SKOV3 cells (P<0.05).Conclusion: In ovarian cancer,miR-132；inhibits proliferation and induces apoptosis of ovarian cancer via Ezrin,it may be a tumor suppressor gene.

miR-132;Ovarian cancer;Proliferation;Apoptosis;Ezrin

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.014

杨 波(1978年-)，男，医学硕士，副主任医师，主要从事妇科恶性肿瘤的基础和临床方面的研究，E-mail：yangbo4836@163.com。

R737.31

A

1000-484X(2017)01-0072-05