扁蒴藤素对支气管哮喘患儿Th17/Treg失衡的影响及意义

陈 娜 韩 洁 高春燕

(唐山妇幼保健院儿内科,唐山063000)

扁蒴藤素对支气管哮喘患儿Th17/Treg失衡的影响及意义

陈 娜 韩 洁 高春燕①

(唐山妇幼保健院儿内科,唐山063000)

目的：探讨扁蒴藤素对支气管哮喘患儿Th17/Treg体外培养细胞的影响及意义，从而探讨免疫因素在支气管哮喘治疗中的机理。 方法：提取支气管哮喘患儿外周血单个核细胞，并在体外给予扁蒴藤素干预，流式细胞术检测Th17及Treg比例，ELISA方法检测细胞培养上清液中IL-17及TGF-β含量变化，实时定量PCR检测RORγT及Foxp3含量。 结果：扁蒴藤素干预组与对照组相比，CD4+IL-17+T细胞(即Th17细胞)表达量显著降低，CD4+CD25+Foxp3+T细胞(即Treg细胞)表达量显著升高，各组均存在统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，IL-17含量显著降低，TGF-β含量显著升高，各组均存在统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，RORγT含量显著降低，Foxp3含量显著升高，各组均存在统计学意义(P<0.05)。 结论：扁蒴藤素干预可较大程度缓解体外培养Th17/Treg细胞失衡，提示该药物可能通过影响免疫平衡来调节哮喘的发生发展，为扁蒴藤素在临床治疗哮喘的应用提供了理论支持。

Th17；Treg；扁蒴藤素；支气管哮喘

哮喘作为影响患儿健康的重要疾病，其发病机制至今未明，但多数研究认为其与机体免疫因素息息相关。Th17及Treg细胞是近年来研究和发现的免疫细胞，在机体的免疫调节和稳态中起着重要作用。已经明确的是，Th17及Treg细胞在哮喘的发病中起着至关重要的作用[1]。扁蒴藤素作为一种单体化合物(Pristimerin)，多是从卫矛科南蛇藤植物中提取而来，具有抗炎、抗类风湿、抗肿瘤及抗氧化等作用[2]。已有研究表明，扁蒴藤素对过敏性哮喘小鼠的气道炎症具有保护作用，可显著降低多种炎性细胞因子的分泌[3]，但其是否可以通过调控Th17及Treg细胞来影响哮喘至今未明。因此，本研究提取哮喘患儿的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，体外给予扁蒴藤素干预，观测Th17/Treg的变化，来探讨扁蒴藤素治疗疾病的免疫机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料 选取2014年1月到2015年10月在我院儿科就诊的哮喘20例，其中男性10例，女性10例，年龄为2～6岁，平均(4.4±0.9)岁。患儿病情符合中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的哮喘诊断标准[3]，均为急性发作,此次发作前4周已停用糖皮质激素等免疫抑制剂，免疫增强剂等，患儿均无严重心、肝疾病史，近期无呼吸道感染。本调查程序符合本单位的伦理学标准并得到批准，且已得到患儿与家属的知情同意。

1.1.2 主要试剂 扁蒴藤素、离子霉素购于Sigma公司，流式抗体CD3抗体，CD4单抗和CD25单抗，IL-17A单抗，Foxp3单抗及FACS透膜剂，及ELISA试剂盒均购于Ebioscience公司，TRIZOL裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real-time)及TaKaRa SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ 试剂盒均购于TaKaRa公司，佛波酯(PMA)，MTS/PMS混合液购于Promga公司。

1.1.3 标本采集 收集哮喘患儿入院时的血液标本9 ml，肝素抗凝。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的分离培养 将血液标本与PBS缓冲液倍比稀释混匀，严格按照说明书进行步骤操作，将混合液轻轻置于淋巴细胞分离液上，4℃，3 000 r/min，离心30 min。轻轻取出离心管，此时会出现分层，将第二层白膜细胞洗出置于另一离心管中，加入PBS清洗，获得PBMC单个核细胞备用。应用RPMI1640培养液(含10%的胎牛血清)调整PBMC至一定浓度，取2 ml/孔至于六孔板中培养，加入CD3(5 mg/ml)及CD28单抗(5 mg/ml)培养刺激，向对应孔中加入一定浓度的扁蒴藤素(即为实验组)，对照组加入等量的PBS溶液培养。将六孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后收集细胞及培养上清，进行相关检测。

1.2.2 MTS检测最佳药物浓度 应用RPMI1640培养液(含10%的胎牛血清)调整PBMC密度为1×105ml-1，取100 μl/孔铺于96孔板中。将扁蒴藤素稀释为不同的浓度，取100 μl加于96孔板中，使其终浓度为100、300、500、700、900 ng/ml，将孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。于培养结束时向每孔加入20 μl的MTS/PMS混合液，培养3 h后，应用光密度仪进行光密度检测，以OD值来反映细胞活性从而代表药物最佳作用浓度。

1.2.3 细胞因子检测 将细胞培养上清-80℃保存，批量检测。IL-17A及TGF-β的含量采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测，操作步骤严格按照说明书进行。

1.2.4 TH17细胞分析 取刺激后的PBMC，PBS反复洗涤，配置成100 μl的单细胞悬液，向上述悬液中加入抗CD4单抗10 μl，4℃避光染色30 min。经PBS洗涤一次后，应用透膜剂，并严格按照说明书步骤进行，加入标记的抗IL-17A单抗10 μl，混匀后室温避光孵育30 min，经PBS洗涤一次后，加入300 μl溶液，斡旋混匀后，上流式细胞仪检测。

1.2.5 Treg细胞分析 取刺激后的PBMC，PBS反复洗涤，配置成100 μl的单细胞悬液，向上述悬液中加入抗CD4及CD25单抗10 μl，4℃避光染色30 min。经PBS洗涤一次后，应用透膜剂，并严格按照说明书步骤进行，加入抗Foxp3单抗10 μl，混匀后室温避光孵育30 min，经PBS洗涤一次后，加入300 μl溶液，斡旋混匀后，上流式细胞仪检测。

1.2.6 mRNA 表达检测 实验所需器械均经高压去RNA酶处理，并经0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理，且实验均在冰块上操作，降低温度对结果的影响。取PBMC，加入1 ml TRIZOL裂解5 min，一次加入三氯甲烷、异丙醇及75%乙醇进行获取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度仪测定浓度及纯度。应用TaKaRa逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real-time)，严格按照说明书，将提取的RNA逆转录为cDNA，并应用TaKaRa SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，进行PCR体系的扩增及反应。其中，引物序列为：β-actin： 5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′和5′-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3′；Foxp3：5′-GCACAAGTGCTTTGTGCGAGT-3′和5′-TGTCTGTGGTTGCAGAC-GTTAT-3′；RORγT： 5′-GCAGCGCTCCAACATCTT-CT-3和5′-ACGTACTGAATGGCCTCGGT-3′ 试验时每个样本和基因做2个相同的复孔。

2 结果

2.1 扁蒴藤素药物最佳作用浓度 PBMC由不同药物浓度的扁蒴藤素刺激后，与未刺激组相比，当药物浓度为300、500、700 ng/ml时，细胞活性均显著升高，且当药物浓度为500 ng/ml，细胞活性达到最大，因此选取500 ng/ml为药物作用最佳浓度，见图1。

图1 不同药物浓度PBMC活性比较(A值,Fig.1 Cell activity of PBMC with different concentrations of pristimerin(A ±s,n=20)Note: Vs control group,*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

图2 各组对象体内Th17/Treg亚群分析Fig.2

2.2 各组对象Th17/Treg亚群分析 给药组与对照组相比，CD4+IL-17+T细胞(即Th17细胞)表达量显著降低，CD4+CD25+Foxp3+T细胞(即Treg细胞)表达量显著升高，各组均存在统计学意义(P<0.05)见图2，表1。

2.3 各组对象细胞因子分泌 给药组与对照组相比，IL-17含量显著降低，TGF-β含量显著升高，各组均存在统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4 各组对象转录因子表达 给药组与对照组相比，RORγT含量显著降低，Foxp3含量显著升高，各组均存在统计学意义(P<0.05)，见图3。

GroupsCD4+IL⁃17+CD4+CD25+Foxp3+Experimentalgroup55±191)59±261)Controlgroup79±1637±21

Note：Vs control group,1)P<0.05.

GroupsIL⁃17TGF⁃βExperimentalgroup2317±371)3458±311)Controlgroup3679±352143±32

Note：Vs control group,1)P<0.05.

图3 各组对象转录因子表达±s,n=20)Fig.3 Expression of transcription factors in each n=20) Note: Vs control group,*.P<0.05.

3 讨论

支气管哮喘是由多种免疫细胞浸润导致的气道慢性变态反应性炎症，其病因和发病机制至今仍未完全明确，其中Th1/Th2平衡失调及Th2细胞在机体占优势地位，被认为是哮喘形成的关键性因素[4]。然而该机制并不能完全解释哮喘的发病机制，Th17及Treg细胞的出现对发病机制进行了补充和完善。作为近年来发现的新型免疫细胞，Th17及Treg细胞，具有独立的分化和调节机制，且互相抑制，Th17的产生可抑制Treg的分化及发育[5,6]。两者之间可通过多种途径和机制互相影响，参与机体稳态的调节。ROR-γT 作为 Th17 细胞的特异性核转录因子，对 Th17 细胞的分化、发育和功能起决定性作用；Foxp3是Treg细胞的一个较为特异性的标记，其可在转录水平上的调控Treg细胞分化与发育，两者均是在转录因子层面反应Th17及Treg细胞的表达。在机体正常状态下，Th17及Treg细胞保持动态平衡，以利于机体多种免疫反应的适当进行。Th17/Treg失衡则导致炎性反应过度，从而参与哮喘的发生发展。已有研究表明[7,8]，卵蛋白致敏的哮喘动物模型体内存在Th17/Treg失衡，并且哮喘患儿体内也存在Th17/Treg失衡，提示Th17/Treg在哮喘的发生发展过程中起着重要作用。

扁蒴藤素作为一种天然单体化合物，传统中医曾把它应用于风湿性关节炎和哮喘的治疗，近年来研究发现，扁蒴藤素还具有多种其他特性[2,3]：①抗炎作用，其可显著降低脂多糖诱导的巨噬细胞的炎症反应，可以降低肿瘤坏死因子、IL-6及一氧化氮合成酶的分泌；还可以显著抑制腹腔白细胞的浸润，降低腹膜通透性和一氧化氮的合成，在抗炎过程中起着重要作用。②抗类风湿作用，扁蒴藤素可抑制关节炎及关节处骨的破坏，扁蒴藤素干预的关节炎模型可见多种炎性因子含量降低，及抑炎性因子IL-10分泌增加。③另有研究发现，扁蒴藤素可有效抑制人类巨细胞病毒对体外培养人胚胎成纤维细胞系的感染，具有较强的抗病毒作用。国内已有研究显示[3]，扁蒴藤素对过敏性哮喘模型的气道炎症具有保护作用，但其更深入的研究仍然缺如。

本研究可以看出，与对照组相比，给药组Th17细胞表达量，IL-17及RORγT含量显著降低，Treg细胞表达量，TGF-β及Foxp3含量显著升高，各组均存在统计学意义(P<0.05)。IL-17作为促炎性因子，可以改变基质金属蛋白酶的数量，引起嗜中性粒细胞向炎症部位聚集，Treg细胞可通过调节Th2细胞来减缓疾病发生发展的作用，其作用可能与TGF-β密切相关[9,10]。以上结果均说明，扁蒴藤素可显著缓解Th17/Treg失衡，提示扁蒴藤素可能通过干预Th17/Treg平衡来影响哮喘的发生发展。这一研究与多数研究吻合[3,10]，均提示扁蒴藤素的抗炎功能，及Th17/Treg平衡在哮喘发病中的重要作用。

综上所述，扁蒴藤素可较大程度缓解Th17/Treg失衡，提示该药物可能通过影响免疫平衡来调节哮喘的发生发展，为扁蒴藤素在临床治疗哮喘的应用提供了理论支持。

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[收稿2016-06-16 修回2016-08-25]

(编辑 许四平)

Influence and significance of pristimerin therapy in patients with allergic asthma on Th17 and Treg

CHENNa，HANJie，GAOChun-Yan.

DepartmentofPediatricInternalMedicine,TangshanMaternalandChildHealthCareHospital，Tangshan063000,China

Objective:To investigate the effects of pristimerin therapy on the functions of Th17 and Treg cells in patients with allergic asthma,and expore the function of immune factors in therapy on allergic asthma. Methods: Extracted mononuclear cells in peripheral blood of patients with allergic asthma,and given pristimerin intervention in vitro.Then used fluorescence-activated cell sorting analysis to detect the contect of Th17 and Treg,enzyme-linked immunosorbent assay to detect cytokine production of IL-17 and TGF-β,and Real-time PCR to detect the contect of RORγT and Foxp3. Results: Compared with the control group,experimental group had reduced expression of CD4+IL-17+T cells (Th17 cells),and increased expression of CD4+CD25+Foxp3+T cells (Treg cells),which all had the statistical significance (P<0.05);displayed decreased level of IL-17,and increased level of TGF-β,which all had the statistical significance (P<0.05);had reduced expression of RORγT,and increased expression of Foxp3,which all had the statistical significance (P<0.05). Conclusion: Pristimerin therapy can remit the unbalance of Th17/Treg in vitro,hinting this drug may regulate allergic asthma by influencing immunologic balance,which offers the theoretical support for pristimerin in clinical application.

Th17；Treg；Pristimerin;Allergic asthma

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.011

陈 娜(1979年-)，女，副主任医师，主要从事儿科方面的研究，E-mail：cccnnn_11@sina.com。

及指导教师：韩 洁(1970年-)，女，主任医师，主要从事小儿血液系统疾病、小儿肿瘤疾病方面的研究。

R562.2+5

A

1000-484X(2017)01-0058-04

①唐山妇幼保健院检验科,唐山063000。