直接灸和隔姜灸“肝俞”穴对原发性肝癌模型大鼠癌前病变期肝功能的影响*

王 宁,谭 丽,闫亚楠,成宇镇,侯中伟,熊博文,冯双双,董 珍

(北京中医药大学，北京 100029)

直接灸和隔姜灸“肝俞”穴对原发性肝癌模型大鼠癌前病变期肝功能的影响*

王 宁,谭 丽,闫亚楠,成宇镇,侯中伟△,熊博文,冯双双,董 珍

(北京中医药大学，北京 100029)

目的：观察直接灸和隔姜灸大鼠“肝俞”穴对原发性肝癌模型大鼠癌前病变期肝功能及肝脏组织形态的影响。方法：将55只雄性Wistar大鼠随机分为正常组(10只)、模型组(15只)、直接灸组(15只)、隔姜灸组(15只)。采用腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN)法制备HCC模型；直接灸组、隔姜灸组在造模的同时分别用小艾炷灸、小艾炷隔姜灸“肝俞”穴，3壮/穴，隔日1次，为期10周。在造模结束后，用Elisa法对各组大鼠血清中谷氨酰转肽酶(GGT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、甲胎蛋白(AFP)进行检测，用HE染色观察大鼠肝脏组织形态学变化。结果：造模结束后，与模型组相比，直接灸组GGT、AFP含量显著降低(P<0.05)，隔姜灸组GGT、AST、ALP、AFP含量均显著降低(均P<0.05)。肝脏组织切片HE染色光镜下观察，模型组出现肿瘤灶，小叶结构完全破坏，异型性增加；直接灸组，癌细胞数量较少，细胞核异型性低，有少量结节形成；隔姜灸组，细胞核深染、未发现结节。结论：直接灸和隔姜灸都能够降低HCC模型大鼠血清中GGT、AST、ALP、AFP的含量，改善肝功能，减轻肝细胞的损伤，且隔姜灸的效果要优于直接灸组。

直接灸;隔姜灸;大鼠;原发性肝癌;肝功能;甲胎蛋白

原发性肝癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)是一种常见的肿瘤，在世界范围内多发。据统计,全球范围内，男性肝癌发病率居第5位,癌症死亡原因占第2位，女性发病率居第7位，癌症死亡原因占第6位[1]。因此，预防肝癌的发生对降低肝癌的发生率和死亡率尤为重要。前期研究表明[2],灸法在预防肝癌发生、抑制肿瘤生长、缓解临床症状、改善肝功能、减轻放化疗中的不良反应和增强免疫力等方面都有一定疗效。本实验拟采用大鼠腹腔注射二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)来建立原发性肝癌模型，研究直接灸和隔姜灸大鼠“肝俞”穴对HCC模型大鼠血清中γ-谷氨酰转肽酶(Glutamyltranspeptidase,GGT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartatetransaminase,AST)、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)、甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)含量及肝脏组织形态的影响，观察直接灸与隔姜灸之间的效果差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

55只清洁级Wistar雄性大鼠，体质量(200±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK京2012-0001)。实验前所有动物适应性饲养1周后，按随机数字表法分为正常组(10只)、模型组(15只)、直接灸组(15只)、隔姜灸组(15只)。由北京中医药大学提供清洁级动物房和实验室，大鼠饲养环境温度为20℃～25℃，湿度为55%左右。由于实验造模过程中大鼠死亡率较高，为了保证实验结束后有足够的样本数，因此在实验开始时适当增加了模型组、直接灸组、隔姜灸组的实验动物数量。实验过程中对动物的处置符合2006年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 药品、试剂和设备

药品：二乙基亚硝胺,浓度0.95 g/ml，购于美国Sigma公司(批号Sigma-N0756)；麻醉剂:戊巴比妥钠，浓度1.5%，由北京中医药大学生理教研室配制。试剂：GGT、AST、ALP检测试剂盒,购于北京环宇金科生物医学技术有限公司；苏木精伊红(HE)染色液，购于北京普利莱基因技术有限公司。仪器：德国LEICARM2245型石蜡切片机；AnymicroDSSTM图像采集系统；艾绒，购于北京中研太和医疗器械有限公司。

1.3 模型制备

模型制备采用腹腔注射法[3]：将DEN溶于0.9%Nacl溶液，配制成浓度为10 mg/ml的溶液。按50 mg/kg的剂量，给大鼠腹腔注射，每周2次，每次间隔3或4天(约84 h)，连续10周；造模成功指征：大鼠形态方面表现为行动迟缓、饮食减少、形体消瘦、体重减轻、毛色发黄无光泽，并出现小便色黄、便血、鼻腔出血等症状。解剖可见腹水，脾脏肿大，肝脏表面出现大量大小不一的结节，肝脏明显萎缩，且质地变硬，肺、胃表面有偶发结节。肝脏病理组织切片出现肿瘤灶，镜下观察肝细胞排列紊乱，小叶塌陷，肝板消失，细胞核深染，核/质比增大，异型性增加。

1.4 干预方法

正常组：正常饲养。模型组：大鼠腹腔注射DEN溶液，剂量为50 mg/kg。直接灸组、隔姜灸组在造模开始的同时，将大鼠穴区2 cm×3 cm的鼠毛剪除，暴露局部皮肤组织，分别用小艾炷直接灸和小艾炷隔姜灸“肝俞”穴，3壮/穴，隔日1次，连续10周(肝俞穴位定位参照《实验针灸学》[4])；艾灸方法：助手采用抓按法固定大鼠，暴露穴区，待大鼠安静后，将艾绒做成约5 mg/壮(1/4麦粒大小)的小艾炷，直接灸组将小艾炷直接放在两侧肝俞穴上点燃，隔姜灸组先将姜片(姜片厚2 mm)固定在大鼠两侧“肝俞”穴上，再将小艾炷放在姜片上点燃，待艾炷燃灭后，易炷再灸。

1.5 观察指标与取材

造模结束后，大鼠尾静脉取血1.5 ml，静置2 h后，以3500 r/min离心15 min，取250 μL血清装入冻存管-80℃保存备用。采用Elisa法按照试剂说明书对血清GGT、AST、ALP进行测定。造模结束后，将各组大鼠称重，采用1.5% 戊巴比妥钠(0.25 ml/100 g) 腹腔注射麻醉大鼠后， 将大鼠肝脏取下称取湿重，并取肝脏组织于甲醛溶液浸泡1周后进行脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、HE染色后光镜下观察大鼠肝脏组织形态学变化。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠造模后血清中GGT、AST、ALP的比较

造模结束后，与正常组相比，模型组GGT、AST、ALP含量均显著增高(P<0.05)，差异有统计学意义；与模型组相比，直接灸组GGT含量显著降低(P<0.05),直接灸组AST、ALP含量降低(P>0.05)；与模型组相比,隔姜灸组GGT、AST、ALP含量均有显著差异(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠造模后GGT、AST、ALP含量的比较

注：与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；实验过程中大鼠有死亡，样本量少于初始量

2.2 各组大鼠造模后血清中AFP的比较

造模结束后，与正常组相比，模型组AFP含量均显著增高(P<0.05)，差异有统计学意义；与模型组相比，直接灸组与隔姜灸组AFP含量均显著降低(P<0.05),且两组之间比较无差异。见图1。

图1 各组大鼠造模后血清AFP含量的比较 注：与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05

2.3 肝脏组织切片HE染色光镜下观察结果

正常组大鼠肝细胞形态正常，肝小梁、肝窦排列正常；模型组出现肿瘤灶，小叶结构完全破坏，肝索消失，核/质比增大，细胞核深染，异型性增加，肝细胞坏死；直接灸组，核/质比略增大，癌细胞数量较少，细胞核异型性低，有少量结节形成；隔姜灸组，细胞核深染、核/质比略增大，未发现结节。见封三彩图2。

3 讨论

肝癌属中医“积聚”范畴，其主要病机是气滞导致的瘀血内结。灸法治疗积聚已有悠久的历史，《景岳全书·卷二十三》载:“火力所到，则其坚聚之气自然以渐解散，有神化之妙也”，说明灸法能够散结化滞，具有神奇的疗效。《素问·咳论》载:“治脏者治其俞”及《素问·阴阳应象大论》载:“阴病治阳”，均说明背俞穴可治疗相应的脏腑病症，故取肝俞穴能够直接、 有效地激发肝脏之气血，达到效应。近代谢锡亮先生多采用直接灸背俞穴治疗肝病，并总结了多例临床验案[5]。也有学者对直接灸法治疗肿瘤化疗后的毒副作用做了临床研究，并且发现，直接灸可以减轻化疗后毒副反应,提高患者生活质量[6]。隔姜灸疗效独特，既发挥了艾灸的作用，又有生姜的功能，在临床应用广泛[7]。目前，在多种肝癌模型制备中,DEN诱发原发性肝癌的发生比较成熟,且与人类肝癌的病程类似[8],故本实验采用比较成熟的DEN诱导HCC模型的造模技术，在造模的同时给予两种不同的灸法干预，以比较直接灸和隔姜灸对HCC模型大鼠血清GGT、AST、ALP及肝脏组织形态的影响。

GGT作为一种质膜结合糖蛋白，广泛分布于人体多种组织中,在肝内主要存在于肝细胞浆和肝内胆管上皮。有学者[9]认为外周血液中GGT含量的增加，不仅与肝脏炎症细胞肿胀、阻塞性黄疸时胆汁或结石的压迫有关，而且与实体肿瘤组织的压迫也有关系,并且GGT的量可能与受挤压的肝细胞数量和受压强度呈正相关。也有研究发现，当肝脏出现癌变时，由于癌细胞逆向分化和肝细胞膜通透性增加，血清GGT活性则会重新升高[10]。AST主要分布于肝细胞的线粒体内，少量分布于肝细胞内，当肝脏发生严重坏死或破坏时，才能引起AST在血清中浓度偏高,因此，AST主要反映肝细胞的损伤程度[11]。ALP是一种磷酸单酯酶，广泛存在于人体组织，经肝脏向胆外排出。胆汁淤积性肝炎、塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌等各种肝病均会造成ALP显著增加，当肝细胞受损或者肝脏功能障碍时，尤其患有肝癌时，ALP明显增高，但ALP单项检测对原发性肝癌的诊断无意义[12-13]。AFP在临床上被认为是肝癌的经典肿瘤标记物，而且现在临床上经常将AFP、GGT、ALP等指标进行联合检测，以提高对肝癌的检出率[14-15]。

在本实验中，直接灸和隔姜灸干预的大鼠血清GGT、AST、ALP、AFP含量均低于模型组，有降低趋势，而隔姜灸组血清指标含量与模型组相比均有显著差异，再结合光镜下肝脏组织HE染色切片的观察结果，说明：①两种灸法均能在一定程度上保护肝功能，可能通过减缓肝细胞间的压力、减轻DEN对大鼠肝细胞的炎性刺激、改善肝细胞膜通透性等方面去降低肝细胞的损伤和癌变；②对GGT、AFP的影响：两种灸法均能降低GGT含量，但组间无统计学差异；对AST、ALP的影响：隔姜灸组对降低AST、ALP的作用效果最佳，但隔姜灸组与直接灸组相比无统计学差异，这可能与样本量的大小、艾灸干预的周期、壮数的大小等有关。综合分析，HCC是一种慢性消耗性疾病，起病缓慢，病程较长，使得机体处于正虚邪实的状态，治疗需要扶正祛邪，而隔姜灸“肝俞”穴对HCC模型大鼠癌前病变期肝功能的作用效果要优于直接灸，根据“少火生气”的理论，可以认为隔姜灸更适合HCC久病体虚的治疗。

[1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30

[2] 柳杨,侯中伟,王朝阳.灸法防治原发性肝癌的临床与实验研究进展[J].世界中医药，2015,10(2):293-296

[3] 姜幼纯，董奇男，肖邦良,等.非坏死剂量二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型的研究[J].华西医科大学学报，2001,20(7):717-719

[4] 张露芬.实验针灸学[M].北京:化学工业出版社，2010:219-220

[5] 关玲,向宏昌,邹怡.谢锡亮先生麦粒灸治疗乙肝30年医案回顾分析[J].中国针灸,2009,29(6):487-490

[6] 张静.麦粒灸对化疗后骨髓抑制及生活质量影响的临床研究[D].南京：南京中医药大学,2014：21

[7] 宋维毅,尤艳利.隔姜灸的临床应用[J].西部中医药,2011,24(12):68-70

[8] Ogawa K.Molecular pathology of early stage chemically induced hepatocarcinogenesis[J].Pathology Internationa,2009,59:605-622

[9] 陆东东,张锡然.肝癌细胞中γ-谷氨酰转肽酶基因甲基化研究[J].中西医结合肝病杂志，2002,12(1):4-5

[10] 杨玉林,贺志安.临床肝病实验诊断学[M].北京:中国中医药出版社,2007：68

[11] 李雪莲,时金艳.HCV感染患者ALT、AST水平与肝癌、肝硬化关系的研究[J].国际检验医学杂志,2014,35(21):1977-1978

[12] 韦仕高,韦霞,韦忠理.血清酶类指标变化对原发性肝癌诊断的临床价值[J].中国误诊学杂志,2010,10(9):2095-2096

[13] 吴彩兰,赵延勋,李彩霞.5种肿瘤标志物检测的诊断意义[J].现代医学，2004,32(1):48-49

[14] 赵斌,赵经川,李昭宇.AFP联合三项血清酶指标对原发性肝癌的诊断评价[J].宁夏医学杂志,2010,32(1):20-21

[15] 陈贞,龙璐,陶亚,等.血清ALP、GGT、5’—NT与AFP联合检测在原发性肝癌诊断中的价值[J].实用预防医学,2012,19(17):1618-1621

Effects of Direct Moxibustion and Ginger Moxibustion at Ganshu Point on Liver Function of Primary Liver Cancer in Rats with Precancerous Lesion

WANG Ning,TAN Li,YAN Ya-nan,CHENG Yu-zhen,HOU Zhong-wei△,XIONG Bo-wen,FENG Shuang-shuang,DONG Zhen

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective：To observe the effect of Direct moxibustion and Ginger moxibustion on liver function and liver tissue morphology of primary liver cancer in rats with precancerous lesion.Methods：A total of 55 male Wistar rats were randomly divided into a normal group (10 rats), a model group (15 rats),a Direct moxibustion group (15 rats) and a Ginger moxibustion group (15 rats).HCC models were prepared by intraperitoneal injection of diethylnitrosamine(DEN).Direct moxibustion group and Ginger moxibustion group were treated by moxa cone at Ganshu point, 3 cones/acupoint, once a day, for a period of 10 weeks.At the end of modeling,glutamyltranspeptidase,aspartatetransaminase and alkaline phosphatase were checked by Elisa.HE staining was used to observe the morphological changes of liver tissues in rats.Results：After modeling, compared with those of the model group,the contents of serum GGT and AFP of the Direct moxibustion group were significantly reduced(P<0.05),and the contents of serum GGT,AST,ALP and AFP of the Ginger moxibustion group were significantly lower(P<0.05). Under the light microscopic observation of liver tissue stained with HE, the model group had tumor formation; lobular structure was completely destroyed; atypia of hyperchromatic nuclei was increased; Direct moxibustion group had a small amount of liver plate,and atypia of liver cell nuclear was low;Ginger moxibustion group had hyperchromatic nuclei deeply stained,without finding nodules.Conclusion：Direct moxibustion and Ginger moxibustion can reduce the contents of GGT, AST and ALP in serum of HCC model rats and can improve the liver function.The effect of Ginger moxibustion is superior to that of Direct moxibustion.

Direct moxibustion;Ginger moxibustion;Rats;Primary liver cancer;Liver function;Alpha fetoprotein

国家自然科学基金青年科学基金项目,编号：81202760。

王宁(1991-)，男，2014级针灸推拿学专业硕士研究生。

△通讯作者：侯中伟(1978-)，男，副教授，研究方向：针灸经典理论与特色疗法。

R246.5

A

1005-0779(2017)02-0045-04

2016-09-12