电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注大鼠凋亡相关因子Bcl-2和Bax表达的影响*

2017-02-15张亚敏陈素辉司英奎

针灸临床杂志 2017年2期

关键词：货号脑缺血电针

张亚敏，孙华，徐虹，陈素辉，司英奎

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院，北京 100730)

电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注大鼠凋亡相关因子Bcl-2和Bax表达的影响*

张亚敏，孙华△，徐虹，陈素辉，司英奎

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院，北京 100730)

目的：观察电针百会、足三里穴对脑缺血大鼠Bcl-2和Bax表达的影响，从细胞凋亡的角度探讨电针治疗该病的机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，根据再灌注时间又分为24 h和72 h组。假手术组：仅分离血管，不插入线栓，固定在布袋20 min，不进行电针治疗。模型组：制作脑缺血再灌注模型，每日固定同假手术组。电针组：电针百会穴和左侧足三里穴，日1次，留针20 min。规定时间点取大鼠脑组织，以免疫蛋白印记法及实时荧光定量PCR法检测缺血脑组织Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达。结果：电针组Bcl-2蛋白及mRNA表达显著高于同一时间点的模型组(P<0.05)，Bax蛋白及mRNA表达显著低于同一时间点的模型组(P<0.05)。结论:电针大鼠百会、足三里穴能上调Bcl-2蛋白及基因表达水平，下调Bax蛋白及基因水平，电针减轻缺血再灌注后脑损伤，可能与上述调节相关。

电针；大脑动脉栓塞；脑缺血再灌注；凋亡

缺血性脑卒中因其高发病率、高致残率和致死率严重威胁人们的健康，尽快恢复缺血区血流是有效的治疗手段，矛盾的是，恢复血流灌注后，损伤有可能进一步加重，称为脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)。前期研究发现[1-2]，电针CIRI大鼠百会、足三里穴能减轻大鼠缺血性脑损伤，其机制尚不明确。细胞凋亡是CIRI病理过程的重要因素，其中Bcl-2家族在调控内源性凋亡途径中起到重要作用，抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax协同作用参与凋亡调控过程[3]，电针百会、足三里穴是否能通过干预Bcl-2及Bax的表达干预细胞凋亡过程尚不明确。本研究以局灶性CIRI大鼠为研究对象，探讨电针百会、足三里穴对CIRI大鼠凋亡相关Bcl-2、Bax 蛋白及mRNA表达的影响，从分子及基因水平探讨电针治疗脑缺血的机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组

选用雄性健康SD大鼠36只,饲养于北京协和医院SPF级屏障环境，动物由实验动物中心提供，许可证号SCXK(京)2012-0001，体质量在230～270 g，实验操作依据北京协和医院实验动物指南。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组和电针组，根据再灌注时间又分为24 h和72 h组，各组每个时间点6只大鼠。

1.2 实验试剂与仪器

主要试剂：水合氯醛(国药集团化学试剂北京有限公司，货号30037527)，兔抗大鼠Bcl-2抗体(美国Santa Cruz Biotechnology，货号sc-492)，兔抗大鼠Bax抗体(美国Cell Signaling Technology，货号CST 3183s)，RNA提取试剂盒(美国Omega，货号R6812)，反转录试剂盒(美国Promega，货号M5301)。主要仪器与耗材：尼龙线栓(北京沙东生物技术公司，货号2636-4A)，长城牌全能脉冲电疗仪(杭州丹顿医疗器械有限公司，货号KWD-808)，PVDF膜(美国Millipore，货号IPVH00010)，紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司，货号UV-2000)，荧光定量PCR仪(美国Bio-rad，货号CFX96)。

1.3 脑缺血再灌注模型制备与各组处理

根据Longa等线栓法[4]及前期实验改良的方法[5-6]制备脑梗死模型，大鼠术前12 h禁食禁水，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)，仰卧固定于手术台，颈部手术区消毒后行正中切口，钝性分离颈部肌肉和结缔组织，充分分离右侧颈总、颈内及颈外动脉。结扎颈外动脉远心端及颈总动脉分出处，显微剪剪小口插入线栓，松开颈外动脉分出处的结扎线，使线栓进入颈总动脉，调整方向沿颈内动脉至大脑中动脉入口至完全闭塞，线栓插入长度约为(18±0.5)mm，固定线栓后缝合皮肤，将大鼠放回笼内。2 h后拔出线栓实现再灌注，大鼠清醒后以Bederson 5级评分法[7]评估其神经功能缺损，1～3分纳入实验。

假手术组:仅分离各动脉但不插入线栓，每日布袋固定20 min。模型组:制作CIRI模型，每日固定同假手术组。电针组：造模成功后，将大鼠装入特制的布袋中固定，露出头部和左下肢，选用百会穴和左侧足三里穴，采用0.5 mm×25 mm毫针刺入约10 mm，接电针仪，采用疏密波(频率2 Hz、强度约2 mA)，留针20 min，1次/天。

1.4 组织取样及检测

各组在规定时间点麻醉后断头取脑，冰上分离缺血区脑组织置于冻存管内，液氮冻存备用。

Western blot法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达：取冻存脑组织，PIPA悬浮脑组织，高速组织匀浆机匀浆(每250 mg组织加1 ml裂解液)，4℃离心12000 rpm×15 min，取上清，BCA法测蛋白含量，配12%、4%的聚丙烯酰胺凝胶，每泳道上样量为20 μg蛋白，电泳分离，然后用半干转膜仪将蛋白条带转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，先后一抗(Bcl-2稀释浓度为1∶200，Bax稀释浓度为1∶1000)，4℃过夜孵育，二抗(1∶3000)孵育1～2 h，ECL曝光显影后定影，以β-actin为内参，凝胶成像系统对胶片进行灰度相对定量分析。

qPCR法检测Bcl-2、Bax mRNA的表达：取冻存脑组织磨碎，加裂解液后匀浆处理，4℃ 12000 rpm离心15 min，取上清，加入异丙醇，室温放置10 min，4℃ 12000 rpm离心10 min，吸弃上清，加入1倍体积75%乙醇沉淀，离心，加入去蛋白液RE，离心，沉淀干燥后溶于DEPC水。1%琼脂糖凝胶进行电泳检测总RNA质量，紫外分光度法测定其浓度和纯度，然后用M-MLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录，用荧光定量PCR仪行实时定量PCR反应。引物设计为，Bcl-2上游：5′-ACACGGTGGTGGAGGAACTC-3′，下游：5′-ACAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3′，Bax上游：5′-GCTAGCAAACTGGTGCTCAAGG-3′，下游：5′-CGGTCCCGAAGTAGGAAAGG-3′，GADPH作为阳性内参照计算目的基因相对定量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 Western blot结果分析

Western blot结果显示，模型组大鼠Bcl-2蛋白表达显著低于假手术组(P<0.05)，且在72 h低于24 h；模型组Bax蛋白表达显著高于假手术组(P<0.05)，且在72 h高于24 h。与模型组相比，电针组Bcl-2蛋白表达显著升高，Bax蛋白表达显著降低，差异均有显著性意义(P<0.05)。电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠Bcl-2、Bax蛋白表达的影响见图1、图2、图3。

图1 各组各时间点大鼠脑缺血区Bcl-2、Bax蛋白表达注:1～6各条带分别代表：脑缺血再灌注24 h的假手术组、模型组、电针组；脑缺血再灌注72 h的假手术组、模型组、电针组

图2 各组各时间点大鼠脑缺血区Bcl-2蛋白表达相对定量注：n=3;与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

图3 各组各时间点大鼠脑缺血区Bax蛋白表达相对定量注：n=3;与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2 qPCR结果分析

qPCR结果显示，与同一时间点模型组相比，电针组Bcl-2 mRNA表达显著升高(P<0.05)，Bax mRNA表达显著降低(P<0.05)。模型组Bcl-2 mRNA表达显著低于假手术组(P<0.05)，在72 h低于24 h；模型组Bax mRNA表达显著高于假手术组(P<0.05)，且在72 h高于24 h。电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠Bcl-2、Bax mRNA表达影响见表1、表2。

表1 各组各时间点大鼠脑缺血区Bcl-2 mRNA表达变化

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表2 各组各时间点大鼠脑缺血区Bax mRNA的表达变化±s)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3 讨论

缺血性脑卒中后多存在肢体活动不利、语言謇涩等多种后遗症，针灸治疗是改善缺血性脑损伤导致的神经功能缺损的重要方法之一，电针结合了传统针灸和电刺激生理效应的双重优势，在脑缺血后神经功能缺损的临床治疗及实验研究中广泛应用[1,8]。中医经络学认为头为精明之府、百脉之宗，历代医家认为“病变在脑，首选督脉”，百会穴别名“三阳五会”，位于头顶部正中央，是治疗缺血性脑血管病的首选，足三里穴为足阳明经的合穴，且为四总穴之一，阳明经多气多血，为十二经之长，主润宗筋，宗筋约束骨骼，使关节滑利，对卒中后肢体活动不利尤为适宜，中风急性期病机为阴阳失调、气血逆乱，以本虚标实为主，二穴合用，有醒脑开窍、调和阴阳、益气养血之效。

细胞死亡分为坏死和凋亡，其中凋亡又称为程序性细胞死亡。缺血性脑卒中的急性期，细胞坏死与凋亡并存，缺血核心区以神经元坏死为主，而缺血半暗带以神经元凋亡为主，研究发现，缺血半暗带并非为静止状态，随着缺血时间延长和程度加深，细胞由凋亡转为坏死[9]，因此，在缺血脑组织神经元出现不可逆性损伤前，通过外界干预缺血半暗带神经元的凋亡是减轻脑梗死和改善神经功能缺损的关键。目前认为Bcl-2家族与凋亡应答调节密切相关，在Bcl-2家族中，Bcl-2、Bcl-xl等被认为是抑制凋亡基因；Bax、Bak等为促凋亡基因，抑制凋亡基因和促凋亡基因的相互作用调节细胞的存活与凋亡[3]。

课题在研究中发现，脑缺血再灌注损伤模型大鼠抑制凋亡的Bcl-2蛋白及mRNA表达下调，而促进凋亡的因子Bax蛋白及mRNA表达上调，可能为缺血后脑损伤的重要病理机制。研究发现，定位于线粒体膜上的Bcl-2的高表达，可通过改变线粒体膜电位，减少细胞色素C的释放等多种机制发挥抑制凋亡的作用，减轻神经元凋亡[10]，而Bcl-2的低表达加剧了脑缺血后的神经损伤[11]。Bax与Bcl-2具有较高的同源性，可以和线粒体外膜的离子通道结合，促使细胞色素C的释放促进细胞凋亡[12]，研究证实脑组织缺血后Bax表达升高导致神经元凋亡，在某些情况下，Bax可不依靠外来刺激就能引起细胞凋亡[13]。Bcl-2与Bax结合形成异源二聚体，抑制Bax的活化，是Bcl-2抗凋亡的重要机制。本研究发现，脑缺血再灌注损伤大鼠经电针百会、足三里穴治疗后，Bcl-2蛋白及mRNA表达显著升高，Bax蛋白及mRNA表达显著降低，与李晓宁等[14]的头电针治疗脑缺血的研究结果一致，Liu等[15]的研究也证实，电针脑缺血大鼠百会、神庭穴能通过调控凋亡相关基因Bcl-2与Bax的表达抑制神经元凋亡，减轻脑缺血大鼠的认知功能障碍，与本次实验研究结果一致，因此笔者推测电针百会、足三里穴可能通过调节Bcl-2/Bax的表达，发挥对内源性细胞凋亡途径的调控作用，对脑组织缺血区神经元产生保护作用。

综上，电针CIRI大鼠百会、足三里穴后，Bcl-2蛋白及基因表达水平显著增高，Bax蛋白及基因水平显著降低，电针治疗可能影响细胞凋亡过程，保护缺血区神经元，减轻缺血性脑损伤，然而脑缺血再灌注损伤的机制十分复杂，包括炎症反应、兴奋性氨基酸毒性、氧化应激反应等多种病理机制[16]，电针百会、足三里穴也可能通过干预其他途径参与脑缺血病理机制，需要后续实验研究探索，为临床针灸防治脑缺血性疾病提供实验依据。

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Effect of Eletro-acupuncture at GV20 and ST36 on the Expression of Bcl-2 and Bax in Rats with Cerebral Ischemia Reperfusion Injury

ZHANG Ya-min,SUN Hua△,XU Hong,CHEN Su-hui,SI Ying-kui

(PekingUnionMedicalCollegeHospital,PekingUnionMedicalCollege,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100730,China)

Objective：To observe the expression levels of Bcl-2 and Bax after treating acute cerebral infarction of rats with eletro-acupuncture so as to investigate the underlying mechanism of electro-acupuncture on ischemic stroke from the angle of apoptosis. Methods：Healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a sham operation (S) group, a model(M)group，an electro-acupuncture (EA) group, and then they were divided into 24h and 72h reperfusion subgroup. The S group and the M groups were bound by a bag for 20min as the rats in EA group. The rats in M group and EA group were made middle carotid artery occlusion reperfusion models. The rats in EA group were treated with electro-acupuncture treatment daily, and GV20 and left ST36 were selected. The protain levels of Bcl-2 and Bax in brain were evaluated by western blot and the mRNA levels of Bcl-2 and Bax in brain were evaluated by Real-time PCR. Results：Compared with the M group, the protein and mRNA levels of Bcl-2 in the EA group significantly increased at the same time point(P<0.05); Bax expressions in EA group were significantly lower than those in M group at the same time point. Conclusion：Electro-acupuncture at GV20 and ST36 can increase the protein and mRNA levels of Bcl-2, and decrease the protein and mRNA expression level of Bax in rat models of MCAO. Electro-acupuncture therapy has a protective effect on the focal CIRI in rats probably by regulating the expressions of Bcl-2 and Bax in the apoptosis process.

Electro-acupuncture；Cerebral artery occlusion；Cerebral ischemia reperfusion；Apoptosis