HNHHJ-1脱硫菌株对DBT的脱硫条件优化*

张宇，张玥，马宁，王志成

（黑龙江省能源环境研究院，黑龙江哈尔滨150090）

HNHHJ-1脱硫菌株对DBT的脱硫条件优化*

张宇，张玥，马宁，王志成

（黑龙江省能源环境研究院，黑龙江哈尔滨150090）

将一株从大庆油田含油土壤中分离筛选得到的专一性脱硫力最高的菌株HNHHJ-1作为培养菌株，通过对DBT转化为2-HBP的脱硫效率来了解初始pH值、氮源、碳源、培养温度和摇瓶转速条件对脱硫力的影响，并优化培养条件。确定的最佳培养条件为：在30℃温度下培养，每250mL三角瓶装100mL培养基，接种量为1%（V/V），转速为180r·min-1。在上述培养条件下培养，2-HBP生成量为22.806mg·L-1。

2-HBP；脱硫菌；条件优化

石油是当今世界的重要能源，同时也是化学工业的主要原料，因此，在每个国家的国民经济生产中都具有举足轻重的地位。随着经济的发展对石油资源的需求量不断加大，同时石油资源的大量消耗所产生的环境污染问题，也成为影响人类生存的重大问题。

石油资源中含有的大量无机硫和有机硫是人类生存环境的重要污染源，其在燃烧时产生的含硫氧化物排入大气，是形成酸雨的主要原因，对环境和生态平衡造成严重的破坏。据报道，我国每年约有25000kt的SO2排入大气，其中大部分来自石油产品的燃烧和精炼过程。另外，石油中的硫还会腐蚀输送管线和贮存设备，使石油精炼的催化剂中毒，因此，石油中的硫化物也是炼油工业的大敌。

石油的总含硫量在0.03%～7.89%之间，除含单质硫、硫化物之外，还有硫醇、噻吩、苯并噻吩、二苯并噻吩类及更为复杂的含硫机化合物约200种，多年的持续开发使得现存含硫量低的化石燃料越来越少，现在每天大约生产6000×104桶原油，硫的平均含量大约为1.1%，未来10年硫的平均含量还将继续增加，达到1.3%以上。随着能源危机的逐步加剧，高硫石油燃料的开发成为必然，而高硫化石燃料必须预先经过脱硫处理才能进一步使用［1-3］。

1 实验部分

1.1 菌种

专一性脱硫菌株HNHHJ-1，来自黑龙江省能源环境研究院环境科学研究室（分离筛选自大庆油田含油土壤）。

1.2 培养基

基础培养基由质量浓度为8.0g·L-1葡萄糖，2.5g·L-1NH4Cl，6.5g·L-1KH2PO4，8.5g·L-1K2HPO4，0.3g· L-1MgCl2·6H2O，分别加入1.0mL·L-1微量元素溶液母液和维生素溶液母液，pH值7.0～7.2。微量元素母液由质量浓度为0.8g·L-1FeCl2·4H2O，0.8g·L-1Zn-Cl2，0.8g·L-1MnCl2·4H2O，0.2g·L-1NaMoO4·2H2O，0.08g·L-1CuCl2，0.08g·L-1NaWO4·2H2O和150mmol· L-1HCl。维生素母液由质量浓度500mg·L-1泛酸钙，300mg·L-1肌醇，500mg·L-1烟酸，500mg·L-1盐酸吡哆醇，300mg·L-1对氨基甲苯和0.8mg·L-1维生素B12。

选择性培养基：将一定浓度的DBT加入到基础培养基中。

1.3 主要药品、试剂和设备

甲醇（HPLC），二苯并噻吩（DBT），蛋白胨，尿素，酵母提取物，葡萄糖，麦芽糖，可溶性淀粉，NH4Cl，NH4NO2，NH4NO3，KH2PO4，K2HPO4，MgCl2·6H2O，FeCl2·4H2O，ZnCl2，MnCl2·4H2O，NaMoO4·2H2O，Cu-Cl2,NaWO4·2HO,HCl，泛酸钙，肌醇，烟酸，盐酸吡哆醇，对氨基甲苯和维生素

超高效液相色谱仪（包括Waters 510泵，柱温箱，Waters PDA检测器和Waters EmpowerTM美国Waters公司）；色谱柱（ACQVITY DPLC@BEH C18，50× 2.1mm，1.7μm美国Waters公司）；超声波清洗机。

1.4 实验方法

1.4.1 脱硫菌HNHHJ-1单因素脱硫条件优化在基础培养基中接种脱硫菌HNHHJ-1，在30℃条件下培养至OD600光度值1.2时，按10%（V/V）的接种量转接到新的选择性培养基中。

（1）对脱硫效果的影响因素一——不同初始pH值条件下为确定在不同pH条件下培养对脱硫效果的影响，保持在基础培养基内培养，温度、转速等其他条件不变的情况下，用0.1mol·L-1NaOH或0.1mol·L-1HCl溶液调节选择性培养基的pH值，分别使培养基的初始pH=5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。

（2）对脱硫效果的影响因素二——不同氮源条件下为确定不同氮源条件下培养对脱硫效果的影响，保持基础培养基内培养，温度、转速等其他条件不变的情况下，改变唯一氮源的种类，使用的氮源分别为质量浓度为0.2%尿素、酵母提取物、蛋白胨、NaNO2、NH4Cl、NH4NO2。

（3）对脱硫效果的影响因素三——不同碳源条件下为确定不同碳源条件下培养对脱硫效果的影响，保持基础培养基内培养，温度、转速等其他条件不变的情况下，改变唯一碳源的种类，使用的碳源分别为质量浓度为10g·L-1葡萄糖或麦芽糖及3g·L-1可溶性淀粉（4g·L-1已经无法完全溶解）。

（4）对脱硫效果的影响因素四——不同培养温度条件下为确定不同温度条件下培养对脱硫效果的影响，保持基础培养基内培养，温度、转速等其他条件不变的情况下，分别选取不同培养温度2、25、28、30、32、35、40℃。

（5）对脱硫效果的影响因素五——不同转速条件下为确定不同转速条件下培养对脱硫效果的影响，保持基础培养基内培养，温度、转速等其他条件不变，分别选用转速为80、100、120、150、180、200 r·min-1。

1.4.2 HPLC法测定2-HBP含量将利用脱硫菌HNHHJ-1培养后的菌液分别转接种于优化前和优化后的培养基中连续培养3d，取100mL培养液，于8000r·min-1离心20mm，取上清液与等体积的正己烷萃取，旋转蒸发去除正己烷，蒸发瓶内残留物用甲醇定容至10mL用UPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 不同初始pH值的影响

图1 初始pH值对脱硫菌脱硫力和生长情况的影响Fig.1 Influence of initial pH on desulfurization force and desulfurization bacterium growth

由图1可见，其脱硫能力在初始pH值为7.0时，菌体浓度已经达到最大值，但也可以看出2-HBP生成量并不高，含量约为12.426mg·L-1；在初始pH值为8.0时，菌体脱硫力达到最大，但菌体生长情况不好，2-HBP含量为23.027mg·L-1；原因可能是在碱性条件下，脱硫酶的活性更好，但菌体生长确不是很好，故初始pH值在7.5时，菌体生长和脱硫力两者都不错，因此，选择7.5为最佳pH值。

2.2 不同氮源的影响

在不同的氮源条件下培养不但对菌体生长有影响，同样对菌株脱硫力也有影响。结果见图2。

图2 不同氮源对脱硫菌脱硫力和生长情况的影响Fig.2 Influence of nitrogen source on desulfurization force and desulfurization bacterium growth

由图2可见菌体HNHHJ-1以有机氮源蛋白胨作为唯一氮源的培养基中，测得发酵液中2-HBP含量为20.925mg·L-1，菌体HNHHJ-1的脱硫力最高。即蛋白胨为最佳有机氮源。菌体HNHHJ-1以无机氮源NH4Cl为唯一氮源的培养基中，测得发酵液中2-HBP含量为21.873mg·L-1，脱硫力达到最大。即NH4Cl为最佳无机氮源。

2.3 不同碳源的影响

菌株在不同的碳源条件下培养对生长影响很大，同时也是决定菌株脱硫力的关键因素。

图3 不同碳源对脱硫菌脱硫力和生长情况的影响Fig.2 Influence of carbon source on desulfurization force and desulfurization bacterium growth

结果由图3可知，无论以葡萄糖、麦芽糖还是可溶性淀粉哪种为唯一碳源，菌体生长情况都差不多，表明这3种碳源对菌体生长影响不大。当可溶性淀粉为唯一碳源时，脱硫力达到最大，测得2-HBP含量为22.892 mg·L-1。故选择可溶性淀粉为最佳碳源。

2.4 培养温度的影响

图4 培养温度对脱硫菌脱硫力和生长情况的影响Fig.4 Influence of incubation temperature on desulfurization force and desulfurization bacterium growth

由图4可知，培养温度对菌体生长情况和脱硫力影响，当温度由20℃上升到30℃时，随着温度的升高，菌体生长情况和脱硫力均下降；当温度高于30℃升高到40℃时，随着温度的上升，菌体生长情况和脱硫力均下降；只有在温度为30℃时，测得2-HBP的生成量约为22.106mg·L-1，且生成量最大，同时菌体HNHHJ-1生长生物量也达到最大吸光值（OD660= 0.258），因为温度是菌体生长代谢和脱硫相关酶活性的重要影响因素，因此，最佳培养温度为30℃。

2.5 摇瓶转速的影响

图5 摇瓶转速对脱硫菌脱硫力和生长情况的影响Fig.5 Influence of shake calabash speed on desulfurization force and desulfurization bacterium growth

由图5可知，摇瓶转速对菌体生长情况和脱硫效率的影响，随着摇瓶转速的升高，菌体生长速率和脱硫效率随着升高，当摇瓶转速升高至180r·min-1时，生长速率和脱硫效率都达到最大值，此时，2-HBP的生成量约等于22.698mg·L-1，；当摇瓶转速升高至180r·min-1后，再升高摇瓶转速，菌体浓度已没有没有明显变化，可以推测出，摇瓶转速达到一定速度后与菌体生长情况已经没有了显著的关系。因此，在研究范围内，以180r·min-1为最佳转速。

3 结论

实验所用菌体为从大庆油田含油土壤中分离纯化得到的一株具有专一性脱硫的微生物，并命名为HNHHJ-1，通过对该菌体进行培养单因素脱硫条件优化和超高效液相法定量检测，得到最优培养方案如下：可溶性淀粉的质量浓度为3.0g·L-1，2.5g·L-1NH4Cl，6.5g·L-1KH2PO4，8.5g·L-1K2HPO4，0.3g·L-1MgCl2·6H2O，分别加入1.0mL·L-1微量元素溶液母液和维生素溶液母液，pH值7.0～7.2。在30℃温度下培养，每250mL三角瓶装100mL培养基，接种量为1%（V/V），转速为180r·min-1。脱硫菌HNHHJ-1在最优条件下培养，2-HBP生成量达到22.806mg·L-1，生成量是优化前的1.5倍。

［1］吴琼.高硫燃煤脱硫菌种的筛选及性能研究［D］.呼和浩特：内蒙古工业大学，2009.

［2］张英，李伟，王妙冬，等.专一性降解含硫杂环化合物菌株的分离和筛选［J］.高校化学工程学报，2005,19（3）：392-397.

［3］王莉丽.脱有机硫微生物的分离、鉴定及其选育［D］.哈尔滨：黑龙江大学，2008.

［4］马挺，佟明友，张全，等.脱硫菌Fds-1的分离鉴定及其对柴油脱硫特性的研究［J］.微生物学报，2006,46（1）：104-110.

Optimal desulfurization conditions of desulfurization strain HNHHJ-1 on DBT desulfurization*

ZHANG Yu，ZHANG Yue，MA Ning，WANG Zhi-cheng
（Energy&Environmental Research Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150090，China）

A high specificity desulfurization strain HNHHJ-1 which was isolated from the Daqing Oilfield oily soil had been studied.By comparing the efficiency of conversion dibenzothiophene（DBT）into 2-hydroxybiphenyl（2-HBP）,the influence of initial pH value,nitrogen source,carbon source,culture temperature and shake calabash speed on desulfurization conditions were investigated.The optimal culture conditions of HNHHJ-1 were finally determined.The results showed that the best culture conditions as follows:100 mL nutrient solution containing in every 250 mL conical flask,the inoculation of biomass was 1%,the speed was 180r·min-1,and the temperature was 30℃.In above optimum conditions,the yield of 2-HBP arrived at 22.806 mg·L-1.

2-HBP;desulfurization strain;conditions optimization

TE626.25

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170111

2016-11-14

科研项目：黑龙江省青年科学基金项目（No.QC2014C028）

张宇（1983-），男，黑龙江肇州人，助理研究员，研究领域：环境与节能技术。

王志成（1973-），男，黑龙江哈尔滨人，研究员级高级工程师，从事生物质能源、替代能源和室内环境研究。