龙胆裂环环烯醚萜类有效成分作用机理的网络药理学研究*

高宁，李天聪，程玉鹏，李弘琨，宁愿

（黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨150040）

龙胆裂环环烯醚萜类有效成分作用机理的网络药理学研究*

高宁，李天聪，程玉鹏*，李弘琨，宁愿

（黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨150040）

目的：采用网络药理学方法对龙胆裂环环烯醚萜类成分药效作用进行分析，探讨其可能的分子机理。方法：将5种龙胆裂环环烯醚萜类成分结构导入PharmMapper进行靶点匹配与预测，将所得靶点信息导入DAVID，富集分析靶点所涉及的GO生物过程与KEGGpathway通路；利用String10与Cytoscape 3.2.1构建靶点蛋白相互作用网络。结果：共得到251个作用靶点，主要富集于蛋白磷酸化等生物学过程以及MAPK信号途径等共26条通路中。蛋白相互作用网络分析表明跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号途径在龙胆药效作用过程中起重要作用。结论：龙胆裂环环烯醚萜类有效成分可能是通过跨膜受体酪氨酸激酶-Ras-MAPK信号传递途径，调控靶点蛋白磷酸化水平，进而影响其他信号通路及代谢途径，最终达到保肝、利胆、健胃、抗炎等功效的。

龙胆苦苷；分子机制；信号通路；网络药理学

龙胆为我国传统中药，最早见于《神农本草经》，称其“味苦涩。主骨间寒热，惊痫邪气，续绝伤，定五脏，杀蛊毒”［1］。《中国药典》（2010版）记载正品龙胆为龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag.、龙胆Gentiana scabra Bge.、三花龙胆Gentiana triflora Pall.或滇龙胆Gentiana rigescens Franch.的干燥根和根茎，并称其味苦、性寒，具有“清热燥湿、泻肝胆火”的功效［2］。现代药理学研究表明，龙胆主要有效成分是以龙胆苦苷为代表的裂环环烯醚萜类化合物，主要的药理作用包括保肝利胆、抗炎镇痛、健胃、抗肿瘤等［3,4］。然而，其药效作用的分子机制尚不清晰，因此，揭示龙胆药理药效的分子机制是目前龙胆研究的热点之一。网络药理学是在现代药理学研究的基础之上提出的药物设计与开发的新方法和新策略，其是以系统生物学为基础，从整体水平观察“药物-靶点-疾病”复杂网络关系，进而指导新药研发及药理作用研究。针对于中药多成分、多靶点的特点，网络药理学能够有效的解决中药复杂网络调控模型的构建并阐明其作用机理［5］。本研究以裂环环烯醚萜类化合物为研究对象，采用网络药理学方法构建龙胆“药效分子-靶点-作用通路”网络模型，以期为阐明龙胆药理作用机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 数据来源

本研究以《中国药典》、《中华本草》为基础[1,2]，结合其它中药龙胆药理学研究文献，筛选得到龙胆苦苷（gentiopicrin）、当药苦苷（swertiamarin）、当药苷（sweroside）、苦龙胆酯苷（amarogentin）、苦当药酯苷（amaroswerin）等5种主要的裂环环烯醚萜类化合物。在TCMSP数据库中搜索各化合物的结构信息并下载相应mol2格式的结构信息文件[6]。将文件导入PharmMapper数据库进行靶点匹配与预测[7]。随后，将得到的药物靶标名称输入Uniprot数据库规范蛋白名称，得到可能与龙胆裂环环烯醚萜类化合物作用的人类相关蛋白靶点。

1.2 靶点蛋白生物学功能注释及相互作用分析

将预测靶点信息列表导入在线分析系统DAVID中[8]，对靶点所涉及的GO与KEGG Pathway进行富集与分析，找到龙胆裂环环烯醚萜类化合物显著影响的生物学过程及代谢通路。同时预测靶点信息导入String 10（http：//http：//string-db.org），得到靶点蛋白间相互作用关系，用以构建PPI网络。

1.3 网络构建分析

将上述筛选分析得到的相互作用关系导入Cytoscape 3.2中，构建“化合物-靶点蛋白-通路”、“靶点蛋白-靶点蛋白”作用网络。另外，利用复合分子检测法（MCODE）对“靶点蛋白-靶点蛋白”的PPI网络进行模块划分。探讨龙胆裂环环烯醚萜类化合物可能的作用机理。

2 结果

2.1 龙胆裂环环烯醚萜类成分靶点信息

通过PharmMapper数据库比对分析，共预测得到251个可能与龙胆裂环环烯醚萜类化合物相互作用的靶点，其中与龙胆苦苷相互作用的靶点有144个、与当药苦苷相互作用的靶点有164个、与当药苷相互作用的靶点有157个、与苦龙胆酯苷相互作用的靶点有149个、与苦当药酯苷相互作用的靶点有164个，与5种化合物均能匹配的靶点有77个。在所有251个靶点中，命中频次前十位的依次是β-分泌酶（Beta-secretase 1，59次）、细胞分裂蛋白激酶2（Celldivision protein kinase 2，51次）、谷胱甘肽S-转移酶P（Glutathione S-transferase P，41次）、凝血酶原（Prothrombin，38次）、酪氨酸蛋白磷酸酶非受体1型（Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 1，36次）、热休克蛋白90α（Heatshock protein HSP 90-alpha，35次）、GTP水解酶HRas（GTPase HRas，27次）、胸苷酸激酶（Thymidylate kinase，27次）、醛糖还原酶（Aldose reductase，19次）以及Ras相关蛋白Rab-5A（Ras-related protein Rab-5A，19次）。

2.2 靶点蛋白生物学功能注释及其所涉及的通路分析结果

对所得蛋白靶点进行富集分析结果表明：龙胆裂环环烯醚萜类成分作用靶点主要富集于蛋白磷酸化（GO：0018108，GO：0046777，GO：0004648，GO：0018212）、细胞信号转导途径调节（GO：0007169，GO：0035556）以及对内源性激素刺激的应答（GO：0009719，GO：0032868，GO：0043434）等生物学过程（见图1）；251个靶点共涉及26条通路。“化合物-靶点-通路”网络模型见图2。

图1 龙胆裂环环烯醚萜类成分作用靶点生物学过程GO富集结果Fig.1 Go term enrichmentresults ofthe targets effected by secoiridoids

图2 龙胆裂环环烯醚萜类成分作用靶点“化合物-靶点-通路”网络（网络中菱形节点为化合物，长方形节点为靶点，圆形节点为生物通路）

2.3 靶点蛋白相互作用PPI网络构建及分析结果

String 10是一个在线的、实时更新的蛋白质相互作用关系数据库，它包含了2000多个物种的近百万对蛋白相互作用关系。利用String10建立靶点蛋白间的作用网络有助于了解各靶点间相互关系并预测龙胆裂环环烯醚萜类成分药效分子机理。靶点蛋白导入String10后所得PPI网络见图3。

图3 龙胆裂环环烯醚萜类化合物靶点蛋白相互作用网络Fig.3 PPI network of targets effected by secoiridoids

随后利用Cytoscape软件中MCODE插件进行网络模块划分，共得到4个模块（见图4）。利用DAVID对各模块所涉及基因进行GO富集分析，结果见表1。

图4 靶点蛋白相互作用网络中的模块Fig.4 Modules in the PPInetwork oftragets

表1 模块相关的GO生物过程Tab.1 Go term of the modules

3 讨论及结论

中药因其疗效确切、毒副作用低，越来越受到医药研究人员及患者的重视与青睐，然而受传统研究方法的影响，大多数中药作用机理的分子机制并不清晰，从而影响了其临床应用。龙胆作为重要的临床用药，其历史悠久，应用广泛，因此，揭示其主要有效成分类裂环环烯醚萜类化合物的药理机制有助于龙胆的合理用药。本研究通过网络药理学的方法，研究了龙胆裂环环烯醚萜类化合物可能的作用靶点及其对机体代谢的调控作用。结果表明，龙胆能够显著调节机体蛋白磷酸化水平，并对酪氨酸激酶信号途径（GO：0007169）、小G蛋白介导的信号途径（GO：0007264）、酶联受体蛋白信号途径（GO：0007167）、Ras蛋白信号转导（GO：0007265）、VEGF信号途径（hsa04370）、MAPK信号途径（hsa04010）等多种信号途径有影响。同时，龙胆作用靶点蛋白还对黏着斑（hsa04510）、黏着连接（hsa04520）以及趋化因子信号转导通路（hsa04062）具有显著影响。现有研究表明，上述途径中，诸如酪氨酸激酶、黏着斑、MAPK信号途径等均与肝损伤、肝细胞纤维化、肝癌密切相关［9］；VEGF信号途径、Ras蛋白与胆囊癌的发病密切相关［10,11］；黏着斑、趋化因子受体、酪氨酸激酶则与胃癌等消化系统疾病有关［12,13］；MAPK信号途径还与TNF-α、IL-6等炎症因子的表达有关［14］。

综上所述，结合靶点PPI网络模块识别结果推测，龙胆裂环环烯醚萜类有效成分可能是通过跨膜受体酪氨酸激酶-Ras-MAPK信号传递途径，调控靶点蛋白磷酸化水平，进而影响其他信号通路及代谢途径，最终达到保肝、利胆、健胃、抗炎等功效的。本研究为深入研究龙胆药理作用的分子机制提供了参考，进一步的裂环环烯醚萜类成分对相关信号转导通路的影响研究将在后续工作中展开。

［1］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（第六册）［M］.上海科学技术出版社,1999.240-245.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010版一部）［M］.中国医药科技出版社,2010.89.

［3］王焱,曾文雪,宋小玲,等.龙胆苦苷药学研究进展及其临床配伍应用［J］.西北药学杂志,2012,27（5）：502-505.

［4］姜凯,黄立秋.龙胆泻肝汤对急性胆囊炎患者治疗效果的临床研究［J］.辽宁中医杂志,2015,42（6）：1255-1257.

［5］刘志华,孙晓波.网络药理学：中医药现代化的新机遇［J］.药学学报,2012,47（6）：696-703.

［6］Jinlong Ru;Peng Li;Jinan Wang;et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines.［J］.Journalof Cheminformatics.2014,6（1）：13.

［7］Liu XF,Sisheng Ouyang,Yu B,eta.PharmMapperServer：a web server for potential drug target identification via pharmacophore mapping approach［J］.Nucleic AcidsResearch,2010,38：W609-W614.

［8］Huang DW,Sherman BT,Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources［J］.Nature Protocol,2009,4（1）：44-57.

［9］Xie L,Yang Y,Rui W,et al.Mitogen-activated protein kinases inhibitors exerts anti-fibrosis by mediating TGF-β/Smad signaling in HepG2 cellsand HSCcells［J］.Acta Pharmacologica Sinica,2013, 34（supplement）.15.

［10］李胜水,许华,李秀清,等.ILK与VEGF在原发性胆囊癌中的表达及意义［J］.国际消化病杂志,2014,34（3）：215-217.

［11］卢晖,夏建兵,翁黎明,等.c-Myc、k-Ras、p16在胆囊癌细胞中的表达及临床意义［J］.上海医药,2014,35（18）：27-29.

［12］Zhao Y,Zhou TH,Li AQ,et al.A Potential Role of Collagens Expression in Distinguishing Between Premalignantand Malignant LesionsinStomach［J］.TheAnatomicalRecord,2009,292（5）：692-700.

［13］何甜,唐慧,杨慧,等.趋化因子受体4和6在慢性浅表性胃炎、癌前病变及胃癌中得表达以意义［J］.中华临床医师杂志（电子版），2011,5（18）：5299-5304.

［14］张志强,王强,陈勇,等.P38MAPK抑制剂对钛颗粒刺激巨噬细胞分泌炎症因子的影响［J］.实用医学杂志,2015,31（4）：533-536.

Mechanism of secoiridoids isolated from gentianae radix et rhizoma based on network*pharmacology*

GAO Ning,LI Tian-cong,CHENG Yu-peng*,LI Hong-kun,NING Yuan
（College of Pharmacy,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China）

Objective：In order to reveal the molecular mechanism of secoiridoids isolated from Gentianae Radix et Rhizoma,this study established an interaction networks based on network pharmacology.Methods：Input the file of structure into PharmMapper to get targets of secoiridoids,then maked the enrichment analysis of GO and KEGG Pathway by DAVID,and established"compound-target-pathway"network by String 10 and Cytoscape.Results：251 proteins were matched to the secoiridoids.Based on the enrichment analysis,the main effect of targets were protein amino acid phosphorylation,MAPK singaling pathway,et al.,and the most important were transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway.Conculsions The secoiridoids were able to effect"transmembrane receptor protein tyrosine kinase-Ras-MAPK"signaling pathway,regulate protein phosphorylation,and cure the disease.

gentiopicrin；molecular mechanism；signaling pathway；network pharmacology

R966

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170114

2016-10-24

国家自然科学基金面上项目（No.81573539）；国家自然科学基金青年科学基金项目（No.81503271）；黑龙江省自然科学基金面上项目（No.H201542）；黑龙江省教育厅科学技术研究项目（No.12531621）；黑龙江中医药中青年科技攻关项目（No.ZQG-040）；黑龙江中医药大学校基金面上项目（No.201012）

高宁（1982-），男，黑龙江省哈尔滨人，讲师，研究方向：中药药性物质基础。

程玉鹏（1966-），男，黑龙江省哈尔滨人，副教授，研究方向：中药生物技术。