内质网跨膜蛋白肌醇需求酶1α介导的凋亡通路在兔骨关节炎发病中的作用及机制

刘广宇 张 杰 张晓峰

(黑龙江中医药大学附属第二医院骨科，黑龙江 哈尔滨 150001)

内质网跨膜蛋白肌醇需求酶1α介导的凋亡通路在兔骨关节炎发病中的作用及机制

刘广宇 张 杰 张晓峰

(黑龙江中医药大学附属第二医院骨科，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的 探讨内质网跨膜蛋白肌醇需求酶(IRE)1α介导的凋亡通路在骨关节炎(OA)发病中的作用及机制。方法 新西兰兔膝关节注射木瓜蛋白酶模拟OA模型，HE染色检测OA关节软骨以及关节滑膜的形态，ELISA法检测OA关节滑膜中炎性因子白细胞介素(IL)-6的含量。检测闭合性松解术关节软骨的组织形态以及IL-6的含量。Western印迹检测IRE1α介导的凋亡通路在OA滑膜中的表达水平。结果 HE染色结果显示木瓜蛋白酶诱导的OA模型中，关节软骨细胞发生明显坏死，纤维组织变性、机化以及纤维蛋白坏死物沉积，ELISA结果显示关节滑膜中的IL-6水平明显升高，闭合性松解术后的OA关节软骨细胞凋亡减少，且关节滑膜中IL-6水平也明显降低。蛋白水平显示OA膝关节滑膜中IRE1α的磷酸化水平以及Caspase3的表达水平明显升高，介导关节软骨细胞的凋亡，而闭合性松解术后Caspase3的表达水平降低。结论 闭合性松解术可缓解OA的症状，抑制IRE1α-Caspase3信号通路介导的凋亡作用。

闭合性松解术;内质网跨膜蛋白肌醇需求酶1α;骨关节炎;凋亡

骨关节炎(OA)目前尚无有效的根治方法，此前西医多采用玻璃酸钠注射液关节腔注射缓解局部疼痛症状，不但远期疗效不理想，而且长期服用会引起严重的副作用，包括胃溃疡、胃出血、肝肾损害等〔1，2〕。闭合性松解术主要是通过减轻关节腔内的内压力，减压和阻断恶性循环，缓解或消除症状，而且可恢复关节的力学平衡，OA痛苦小、见效快，更易为医生或患者接受。研究发现，骨关节软骨细胞的过度凋亡会破坏软骨发育和关节区的稳态，可能参与了膝OA的发生和发展〔3〕。内质网跨膜蛋白肌醇需求酶(IRE)1α是适应性未折叠蛋白响应(UPR)中最保守也是最早发现的一个分支〔4〕。IRE1α是I型内质网跨膜蛋白，它的氨基端含有一个内质网腔内结构域，羧基端含有一个激酶结构域和核酸内切酶结构域，IRE1α对Hac1或者切割XBP1产生XBP1s后者翻译出一个更长、更稳定也更有转录活性的转录因子XBP1〔5〕。IRE1α还可以激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)和半胱天冬酶(Caspase)3介导内质网应激诱导的凋亡。本文旨在探究闭合性松解术缓解OA的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 戊巴比妥钠、木瓜蛋白酶购自Sigma公司，10%甲醛购自上海银海圣生物科技有限公司。微量移液器(Eppendorf公司)，冷冻式离心机以及高速离心机(Eppendorf公司)，NanoDrop紫外分光光度计(Thermo)。IRE1α抗体、p-IRE1α抗体、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3抗体和β-actin抗体购自上海银海圣生物科技有限公司。

1.2 新西兰兔的饲养条件 试验中所用的雄性新西兰兔均由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，新西兰兔可自由进食及饮水，饲养于温度(23±2)℃、湿度(36±4)%、昼夜循环周期为12 h的SPF级动物房中。所有新西兰兔实验操作方法和操作程序都得到医院实验动物管理和使用委员会以及伦理委员会的批准。

1.3 新西兰兔OA动物模型的制备以及处理 将40只新西兰兔随机分为治疗组、对照组、模型组、假模组，每组10只，均采用1%戊巴比妥钠(3 ml/kg)兔耳静脉麻醉。前三组兔左侧卧位用75%酒精棉球消毒下肢3遍并用剃毛器腿部兔毛。于膝关节稍外侧进针，针头从下向上前斜刺入直到针头的阻力突然变小，然后针头稍微外退垂直进入关节腔，待出现落空感表明针头已经进入关节腔，其中前三组为缓慢推注4%的木瓜蛋白酶0.5 ml，关节腔正常组织不做任何处理,制备OA模型，假模组为等量的生理盐水，推注量为1.2 ml/kg。造模2 w后，治疗组使用小针刀配合捏拿手法治疗。小针刀治疗首先暴露兔右侧膝关节，观察患肢是否出现肿胀、变形和肌肉萎缩；对膝关节进行按压检查，压痛点：内外侧支持带、内外侧膝眼；膝关节上方髌上囊、股四头肌各肌肌腹，膝关节内侧股薄肌肌腹及止点、收肌肌群肌腹及止点和胫骨平台附近。针刀松解每次选取上述部位压痛点10个，按针刀四步进针法对局部压痛点或病理性条索状物进行切割松解。捏拿手法由上而下捏拿兔右下肢股四头肌,继先顺时针后逆时针旋转揉按患膝髌骨、屈伸牵张膝关节,每次每只兔施术10 min,1次/w,连续治疗5 w共5次，丹参注射液0.3 ml关节腔注射每1次，连用5 w。对照组每周每只兔右膝关节内注射玻璃酸钠注射液0.6 ml,注射后屈伸膝关节20次,连用5 w。模型组及假模组不作任何处理,所有动物同样条件下关养。闭合松解术后5 w 3%戊巴比妥钠麻醉，解剖暴露出膝关节，观察关节滑膜的形态和颜色以及是否与周围组织粘连。取关节面上的软骨组织用于苏木素-伊红(HE)染色，关节滑膜置于-80℃冰箱保存用于后续ELISA检测。

1.4 关节滑膜的HE染色 参照常规的HE染色步骤，取材与固定，脱水透明，浸蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，酒精水化，HE染色液染色，经纯酒精脱水和二甲苯透化，树胶封片即可，然后显微镜下观察关节软骨组织的结构。

1.5 ELISA检测关节滑膜炎性因子白细胞介素(IL)-6 检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，检测原理均双抗体夹心法，通过标准曲线计算IL-6的含量。

1.6 Western印迹检测 滑膜组织用RIPA裂解后进行蛋白浓度测定，用10%的十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上样电泳，电泳结束后将分离胶切出，做成滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸夹心(负极-正极)，放入Bio-Rad湿转装置，以350 mA恒流将蛋白电转到PVDF膜上。转膜完成后，按照膜上的彩色蛋白Marker根据要检测蛋白大小切割出不同的膜条，用含5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h。封闭结束后用一抗4℃过夜孵育，用Tris盐酸缓冲液(TBST)摇床室温洗膜3次后加入二抗室温结合2 h，再用TBST洗膜3次显影。

1.7 统计学方法 应用SPSS16.0 软件，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2结 果

2.1 HE染色检测新西兰兔造模后的软骨形态 木瓜蛋白酶处理后兔关节滑膜色泽比较昏暗，组织疏松，表面有明显的炎性渗出，滑膜厚度较薄，部分与软骨粘连且破损漏出滑膜下软骨，附着于关节软骨周缘的部分发生明显的纤维粘连。HE染色显示生理盐水组关节滑膜颜色正常，呈现出表面平滑光亮、粉红色且柔润的滑膜结缔组织结构；HE染色可见明显的关节软骨细胞形态。模型组显示关节软骨细胞多已经坏死，未见明显的软骨细胞，纤维组织变性、增生及机化，纤维素及类纤维蛋白坏死物沉积。见图1。

图1 新西兰兔OA造模后滑膜形态

2.2 造模后关节滑膜中IL-6因子含量 造模后，关节滑膜中IL-6的含量〔(12.46±4.58)pg/ml〕较对照组〔(5.21±2.27)pg/ml〕明显升高(P<0.05)。

2.3 HE染色检测闭合性松解术对OA滑膜形态的影响 模型组的OA滑膜色泽比较暗淡，且厚薄不均，部分滑膜发生粘连和破损，HE染色显示关节软骨细胞多发生坏死，未见明显的细胞形态，多为变性的纤维蛋白。治疗组关节滑膜颜色较鲜红，滑膜整体形态光滑且粘连较少，HE染色显示关节软骨细胞形态尚可，细胞变性程度较轻，变形蛋白堆积较少。对照组关节滑膜颜色略鲜红，滑膜整体形态光滑且粘连较少，HE染色显示关节软骨细胞形态尚可，细胞变性程度略轻，变形蛋白堆积略少，见图2。

2.4 闭合性松解术对OA滑膜中IL-6含量的影响 治疗组滑膜中IL-6的表达〔(3.25±1.81)pg/ml〕较模型组〔(15.21±1.39)pg/ml〕明显降低(P<0.01)。

2.5 Western印迹检测IRE1α介导的凋亡通路在OA滑膜中的表达水平 如图3所示，模型组膝关节滑膜中IRE1α的磷酸化水平以及Caspase3的表达水平明显升高，闭合性松解术后Caspase3的表达水平降低，表明OA中伴有IRE1α-Caspase3凋亡通路的激活，而闭合性松解术可抑制IRE1α-Caspase3凋亡通路的激活。

图3 IRE1α介导的凋亡通路在OA新西兰兔滑膜中的表达水平

3 讨 论

软骨细胞凋亡异常是OA发病的重要原因〔6，7〕。随着对软骨细胞凋亡研究的深入，发现细胞凋亡和OA的发生发展较为密切〔8〕，其发生机制以及各种因素之间相互作用的关系仍不十分清楚。研究发现多种因素如炎症〔9〕、氧化应激〔10〕、内质网应激〔11〕等均可引起关节软骨细胞的凋亡，且关节软骨细胞凋亡参与了OA的发病。Kim等〔12〕应用TUNEL染色法显示OA组新西兰兔软骨细胞凋亡率明显高于对照组，且OA软骨细胞凋亡主要位于软骨表层和中层。同时有研究发现应用流式细胞仪检测OA软骨细胞凋亡率约为22.3%明显高于正常对照组(4.8%)〔13〕。这表明OA是一种由于软骨细胞凋亡增加所致的坏死性疾病。目前研究发现参与软骨细胞凋亡的信号通路包括：(1)NO途径。NO上调Caspase-3的活性，促进软骨细胞的凋亡数量〔14〕。(2)Fas途径。Fas作用于细胞表面的FasL介导细胞内的凋亡通路〔15〕。(3)Caspase凋亡级联通路。p53基因表达产物的聚集上调Bax的表达，促进细胞色素C的释放并激活Caspase级联反应导致细胞发生凋亡〔16〕。本研究结果显示OA中关节软骨细胞发生明显的凋亡，且关节滑膜中炎性因子IL-6水平升高；IRE1α-Caspase 3凋亡通路在OA的发病中具有重要的角色。综上所述，本研究发现IRE1α通过上调关节软骨细胞中Caspase3的表达水平，诱导关节软骨细胞的凋亡，明确了IRE1α-Caspase 3信号通路对关节软骨细胞的促凋亡作用。

1 Zhang XL,Yang J,Yang L,etal.Efficacy and safety of Zhuanggu joint capsules in combination with celecoxib in knee osteoarthritis:a multi-center,randomized,double-blind,double-dummy,and parallel controlled trial〔J〕.Chin Med J(Engl),2016;129(8):891-7.

2 Seon JK,Song EK.Joint line and patellar height restoration after revision total knee arthroplasty〔J〕.Indian J Orthop,2016;50(2):159-65.

3 Sancheti KH,Sancheti PK,Joshi RS,etal.Midterm survivorship and clin-ical outcome of INDUS knee prosthesis:5 year followup study〔J〕.Indian J Orthop,2016;50(2):131-5.

4 Cui Y,Zhao D,Barrow PA,etal.The endoplasmic reticulum stress response:a link with tuberculosis〔J〕?Tuberculosis(Edinb),2016;97:52-6.

5 Noel C,Simard JC,Girard D.Gold nanoparticles induce apoptosis,endoplasmic reticulum stress events and cleavage of cytoskeletal proteins in human neutrophils〔J〕.Toxicol In Vitro,2016;31(1):12-22.

6 Joo H,Lee HJ,Shin EA,etal.c-Jun N-terminal kinase-dependent endoplasmic reticulum stress pathway is critically involved in arjunic acid induced apoptosis in non-small cell lung cancer cells〔J〕.Phytother Res,2016;30(4):596-603.

7 Takahashi K,Hashimoto S,Kurosaki H,etal.A pilot study comparing the efficacy of radiofrequency and microwave diathermy in combination with intra-articular injection of hyaluronic acid in knee osteoarthritis〔J〕.J Phys Ther Sci,2016;28(2):525-9.

8 Van Spil WE,Agricola R,Drossaers-Bakker KW,etal.Associations of markers of matrix metabolism,inflammation markers,and adipokines with superior cam deformity of the hip and their relation with future hip osteoarthritis〔J〕.Osteoarthritis Cartilage,2015;23(11):1897-905.

9 Daghestani HN,Kraus VB.Inflammatory biomarkers in osteoarthritis〔J〕.Osteoarthritis Cartilage,2015;23(11):1890-6.

10 Chan DD,Xiao WF,Li J,etal.Deficiency of hyaluronan synthase 1(Has 1)results in chronic joint inflammation and widespread intra-articular fibrosis in a murine model of knee joint cartilage damage〔J〕.Osteoarthritis Cartilage,2015;23(11):1879-89.

11 Pippenger BE,Duhr R,Muraro MG,etal.Multicolor flow cytometry-based cellular phenotyping identifies osteoprogenitors and inflammatory cells in the osteoarthritic subchondral bone marrow compartment〔J〕.Osteoarthritis Cartilage,2015;23(11):1865-9.

12 Kim HS,Yoon YC,Park KJ,etal.Interposition of the posterior cruciate ligament into the medial compartment of the knee joint on coronal magnetic resonance imaging〔J〕.Korean J Radiol,2016;17(2):239-44.

13 Lopa S,Leijs MJ,Moretti M,etal.Arthritic and non-arthritic synovial fluids modulate IL10 and IL1RA gene expression in differentially activated primary human monocytes〔J〕.Osteoarthritis Cartilage,2015;23(11):1853-7.

14 Deligne C,Casulli S,Pigenet A,etal.Differential expression of interleukin-17 and interleukin-22 in inflamed and non-inflamed synovium from osteoarthritis patients〔J〕.Osteoarthritis Cartilage,2015;23(11):1843-52.

15 Lieberthal J,Sambamurthy N,Scanzello CR.Inflammation in joint injury and post-traumatic osteoarthritis〔J〕.Osteoarthritis Cartilage,2015;23(11):1825-34.

16 Wenger D,Siversson C,Dahlberg LE,etal.Residual hip dysplasia at 1 year after treatment for neonatal hip instability is not related to degenerative joint disease in young adulthood:a 21-year follow-up study including dGEMRIC〔J〕.Osteoarthritis Cartilage,2016;24(3):436-42.

〔2015-12-14修回〕

(编辑 袁左鸣)

黑龙江中医药大学科研基金项目(201310)

刘广宇(1979-)，男，主治医师，主要从事中医微创治疗骨病研究。

R68

A

1005-9202(2017)02-0291-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.014