去甲肾上腺素对人肝细胞系表达瘦素及瘦素受体的影响

刘 娜 穆 华 梁传栋 郑吉敏

(河北省人民医院消化内科，河北 石家庄 050051)

去甲肾上腺素对人肝细胞系表达瘦素及瘦素受体的影响

刘 娜 穆 华 梁传栋1郑吉敏

(河北省人民医院消化内科，河北 石家庄 050051)

目的 探讨交感神经递质去甲肾上腺素(NE)对体外培养人肝细胞系L02表达瘦素及瘦素受体的影响。方法 用不同浓度的NE作用于体外培养的人肝细胞系L02，分别于24、48及72 h收集细胞，Western印迹法检测其表达瘦素及瘦素受体蛋白的影响；RT-PCR检测NE对肝细胞系L02瘦素及瘦素受体mRNA的影响。结果 ①Western印迹结果显示，1、10、100 μmol/L NE作用于L02 细胞24 h后，瘦素蛋白表达明显高于对照组(1.02±0.08,2.24±0.09,2.35±0.12 vs 0.62±0.09,P<0.05)；瘦素受体蛋白表达亦明显高于对照组(1.35±0.13,2.37±0.12,2.39±0.15 vs 0.85±0.13,P<0.05)。②RT-PCR检测L02瘦素以及瘦素受体mRNA的表达情况，1、10、100 μmol/L NE作用于L02 24 h后，瘦素mRNA表达明显高于对照组(1.54±0.08,2.37±0.09,2.72±0.12 vs 1.00±0.07,P<0.05);瘦素受体mRNA表达亦明显高于对照组(1.61±0.08,2.27±0.10,3.39±0.11 vs 1.00±0.06,P<0.01)。结论 交感神经递质NE对体外培养的肝细胞系瘦素以及瘦素受体的表达均有促进作用，从而参与了肝纤维化进程。

肝细胞；肝纤维化；去甲肾上腺素；瘦素；可溶性瘦素受体

瘦素参与了肝纤维化进程〔1〕。研究发现在非酒精性脂肪肝患者中血清瘦素水平增高,瘦素可以促进肝星状细胞(HSC)增殖,并抑制HSC细胞凋亡〔2〕。交感神经系统也参与了肝纤维化的进程，交感神经递质去甲肾上腺素(NE)能增加HSC数目,并使其活化〔3〕,但对肝细胞的影响鲜有报道。本文旨在探讨NE对体外培养人肝细胞系L02表达瘦素及其受体的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及实验仪器 RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，β-actin 兔抗人单抗购自北京博奥森公司，兔抗人瘦素抗体、兔抗人瘦素受体抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，逆转录反应体系、SYBR Green Real Master Mix、TRIzol试剂盒购自中国北京天根公司；PCR 扩增用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。NE购自美国Sigma公司；人肝细胞系L02购自山东省医学科学院，其他试剂为分析纯。主要仪器有超净工作台、二氧化碳培养箱(Precision Co,美国)，倒置相差显微镜(Olympus,日本)。

1.2 细胞培养及分组 将冷冻保存的人肝细胞系L02复苏后接种于含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和4 mmol/ml谷氨酰胺的RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2的培养箱内培养。细胞分为以下四组：①空白对照组，为单纯L02培养；②低浓度NE组(1 μmol/L)；③中浓度NE组(10 μmol/L)；④高浓度NE组(100 μmol/L)。

1.3 Western印迹检测瘦素以及瘦素受体蛋白的变化 取对数生长期细胞，加1、10、100 μmol/L NE继续培养24、48及72 h后收集细胞，提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝比色法测定蛋白含量。以8%的SDS-PAGE凝胶作为分离胶电泳，转膜，封闭，分别以兔抗人痩素抗体、兔抗人痩素受体抗体(1∶200)和兔抗人β-actin多克隆抗体(1∶200)作为第一抗体反应；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)作为第二抗体反应。采用电化学发光(ECL)剂，进一步显影、定影，结果以目的蛋白与β-actin的积分光密度值的比值表示。密度扫描分析采用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件对Western印迹结果进行定量分析，灰度值以积分光密度值(IOD)表示。

1.4 RT-PCR检测NE对LQZ表达瘦素及瘦素受体的影响 (1)采用TRIzol试剂盒，提取L02总RNA，逆转录合成cDNA；瘦素、瘦素受体及内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物参照Genebank基因序列自行设计，由北京赛百盛基因有限公司合成。引物设计与合成如下：瘦素(正义：5'-CAATGACATTTCACACACGCAG-3'，反义：5'-AGATGGAGGAGGTCTCGCAG-3'，扩增产物大小为204 bp)。瘦素受体(正义：5'-GTGTCCTTCCTGACTCCGTAG-3'，反义：5'-GTTATTCTCTGGAAAGACTGGCT-3'，扩增产物大小为119 bp)。GAPDH(正义：5'TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA 3'，反义：5' AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT 3'，扩增产物大小为259 bp)。(2)在PE5700实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时定量扩增。SYBR反应体系25 μl。反应条件：93℃ 5 min，1个循环；93℃ 45 s，55℃ 1 min，10个循环；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30个循环。利用实时荧光定量PCR仪自带软件进行分析，获得产物的Ct值。采用相对定量2-△△Ct法比较瘦素、瘦素受体基因在各组中的表达差异。

1.5 统计学处理 采用SPSS12.0软件进行单因素方差分析及q检验。

2 结 果

2.1 NE对L02细胞作用后的瘦素及瘦素受体蛋白表达的影响 如图1所示，分别在大约16 kD、5.1 kD位置出现瘦素、瘦素受体特异性条带，在43 kD位置可见β-actin条带。结果证实，1、10、100 μmol/L NE作用于L02细胞24 h后，瘦素蛋白表达明显高于对照组(1.02±0.08,2.24±0.09,2.35±0.12 vs 0.62±0.09,F=519.348，P<0.05)；瘦素受体蛋白表达亦明显高于对照组(1.35±0.13,2.37±0.12,2.39±0.15 vs 0.85±0.13,F=217.285，P<0.05)；见图1。

1～4：对照组，1、10、100 μmol/L组图1 Western印迹检测NE作用于L02 细胞24 h 后表达瘦素及瘦素受体表达

2.2 NE对L02细胞作用后的瘦素及瘦素受体mRNA表达的影响 1、10、100 μmol/L NE作用于L02细胞24 h后，瘦素mRNA表达明显高于对照组(1.54±0.08,2.37±0.09,2.72±0.12 vs 1.00±0.07,F=1 241.751，P<0.05);瘦素受体mRNA表达亦明显高于对照组(1.61±0.08,2.27±0.10,3.39±0.11 vs 1.00±0.06,F=751.254,P<0.01)。

3 讨 论

瘦素是由肥胖基因所编码的一种由167 个氨基酸组成的分泌型蛋白质。瘦素作为一种肽类激素,其生物学效应由瘦素受体介导，其中可溶性瘦素受体是主要的功能性受体。瘦素主要通过与可溶性瘦素受体结合发挥作用。近年来研究显示瘦素与纤维化形成有关，瘦素在非酒精性脂肪肝、丙肝及肝硬化等慢性肝病中的作用已引起众多学者的关注〔4〕。非酒精性脂肪肝患者血清中瘦素水平明显增高，而瘦素是肝星状细胞的强有力促有丝分裂因子,并抑制肝星状细胞的细胞凋亡〔5,6〕。Oben等〔7〕通过动物实验发现痩素缺陷性ob/ob大鼠形成肝损伤，如补充瘦素可使肝纤维化加重；但对于对照大鼠注射同样剂量的瘦素却意义不大，说明依赖瘦素且与损伤关联的因素可参与肝纤维化的进展。交感神经系统参与了体内各个系统的功能调节，肝脏也不例外。交感神经递质NE也能增加肝星状细胞数目，促进纤维化的形成〔8,9〕。表达低儿茶酚胺水平或低交感活性的痩素缺陷性ob/ob小鼠经研究显示可以产生肝纤维化抵抗，当给予动物肝细胞毒性饮食，NE缺乏的大鼠纤维化形成过程减慢，当给予补充促肾上腺素释放物质时，这种现象消失，认为NE直接作用于肝脏，以调节并削弱瘦素对肝纤维化的促进作用〔10〕。由此可见，瘦素的促进纤维化的形成作用可能需要NE参与调节〔11〕。肝细胞作为肝脏的主要实质细胞，瘦素对于肝细胞的作用是否需要NE的介导仍不明确。本研究提示NE确实介导了肝细胞瘦素以及瘦素受体的表达，从而参与了肝纤维化的过程。但是NE对于肝细胞的生物学行为的调节作用仍不明确，关于瘦素和瘦素受体在肝纤维化形成过程中具体作用机制也需要进一步的实验证实，以期为临床上肝纤维化/肝硬化的治疗提供更加精确的理论依据。

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10 刘 娜,张晓岚.肝纤维化过程中去甲肾上腺素各受体亚型表达的动态变化〔J〕.中华肝脏病杂志,2009;17(9):653-6.

11 刘 娜,张晓岚,姚冬梅,等.去甲肾上腺素对体外肝星状细胞系凋亡的影响〔J〕.基础医学与临床,2008;28(1):64-9.

〔2015-08-12修回〕

(编辑 曹梦园)

河北省卫生厅课题(ZL20140250)

刘 娜(1979-)，女，博士，主治医师，主要从事肝纤维化的治疗研究。

R575.2

A

1005-9202(2017)02-0276-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.007

1 河北省人民医院神经外二科